一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞zui易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
二、操作步骤
（一）冻存
1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
三、试剂和器材
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等
试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

DU145(前列腺癌细胞) 
Lncap(前列腺癌细胞) 
PC-3(前列腺癌细胞) 
MOLT-4(急性淋巴母细胞白血病细胞) 
5637(膀胱癌细胞) 
Raji(Burkitt's 淋巴瘤细胞) 
SCaBER(膀胱鳞癌细胞) 
NAMALWA(Burkitt's 淋巴瘤细胞) 
T24(膀胱移行细胞癌细胞) 
HuT78(T淋巴细胞白血病细胞) 
SW-13(肾上腺皮质腺癌细胞 ) 
SW-13(肾上腺皮质腺癌细胞 ) 
Dami(巨核细胞白血病细胞) 
OS-RC-2(肾癌细胞) 
MEG-01 
786-O [786-0](肾透明细胞腺癌细胞) 
786-O [786-0](肾透明细胞腺癌细胞) 
K-562(慢性髓原白血病细胞) 
K-562(慢性髓原白血病细胞) 
Hce-8693(盲肠腺癌细胞(未分化)) 
HEL299(红白细胞白血病细胞) 
CW-2(结肠腺癌细胞) 
A-375 [A375](恶性黑色素瘤细胞) 
COLO-320(结肠腺癌细胞) 
A172(胶质母细胞瘤细胞) 
SW480 [SW-480](结肠癌细胞) 
SHG-44(胶质瘤细胞) 
Caco-2(结肠腺癌细胞) 
Caco-2(结肠腺癌细胞) 
U251(胶质瘤细胞) 
LS 174T(结肠腺癌细胞) 
SK-N-MC(神经上皮瘤细胞) 
SK-N-MC(神经上皮瘤细胞) 
BxPC-3(原位胰腺腺癌细胞) 
BxPC-3(原位胰腺腺癌细胞) 
KP-N-NS(肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)) 
AsPC-1(转移胰腺腺癌细胞) 
AsPC-1(转移胰腺腺癌细胞) 
U-2 OS(骨肉瘤细胞) 
U-2 OS(骨肉瘤细胞) 
GBC-SD(胆囊癌细胞) 
RD(恶性胚胎横纹肌瘤细胞) 
RD(恶性胚胎横纹肌瘤细胞) 
HCCC-9810(胆管细胞型肝癌细胞) 
A-673(横纹肌瘤细胞) 
SMMC-7721(肝癌细胞) 
SMC-1(胸膜细胞瘤) 
QGY-7703(肝癌细胞) 
NCI-H446 [H446](小细胞肺癌细胞) 
QGY-7701(肝癌细胞) 
BEL-7405(肝癌细胞) 
NCI-H460 [H460](大细胞肺癌细胞0 
NCI-H460 [H460](大细胞肺癌细胞0 
BEL-7404(肝癌细胞) 
BEL-7402(肝癌细胞) 
QG-56(肺扁平上皮癌细胞) 
SPC-A-1(肺腺癌细胞) 
HGC-27(胃癌细胞（未分化）) 
LTEP-a-2(肺腺癌细胞) 
AGS(胃腺癌细胞) 
MGC80-3(胃癌细胞) 
95-D(高转移肺癌细胞) 
BGC-823(胃腺癌细胞（低分化）) 
BT549(乳腺管癌细胞) 
SGC-7901(胃腺癌细胞) 
T-47D(乳腺管癌细胞) 
T-47D(乳腺管癌细胞) 
TE-11(食管癌细胞) 
SK-BR-3(乳腺腺癌细胞) 
SK-BR-3(乳腺腺癌细胞) 
TE-10(食管癌细胞) 
ZR-75-30(乳腺癌细胞) 
TE-1(食管癌细胞) 
Bcap-37(乳腺癌细胞) 
Eca-109(食管癌细胞) 
MDA-MB-453(乳腺癌细胞) 
CNE(鼻咽癌细胞) 
JAR(胎盘绒毛癌细胞) 
HEp-2(喉表皮样癌细胞) 
NIH:OVCAR-3(卵巢癌细胞) 
KB(口腔表皮样癌细胞) 
SK-OV-3(卵巢癌细胞) 
Acc-3(涎腺腺样囊性癌细胞) 
HO-8910PM(高转移卵巢癌细胞) 
Acc-2(涎腺腺样囊性癌细胞) 
HO-8910(卵巢癌细胞) 
Tca-8113(舌鳞癌细胞) 
HCC 94 [HCC941122](子宫鳞癌细胞（高分化）) 
A-431(表皮癌细胞) 
HeLa 229(宫颈癌细胞) 
CBRH-7919(肝癌细胞) 
RH-35(肝癌细胞) 
SHZ-88(乳腺癌细胞) 
MLTC-1(睾丸间质细胞瘤细胞) 
L6565(小鼠L6565白血病克隆细胞系) 
F9(畸胎瘤细胞) 
LLC Lewis(肺癌细胞) 
C127(乳腺肿瘤细胞) 
MFC(胃癌细胞) 
B16(黑色素瘤细胞) 
B16(黑色素瘤细胞) 
P815(肥大细胞瘤细胞) 
S-180(腹水瘤细胞) 
RM-1(前列腺癌细胞) 
SAC-IIC3(腹水瘤细胞) 
NG108-15 [ 108CC15 ](小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞) 
SAC-IIB2(腹水瘤细胞) 
Hepa 1-6(肝癌细胞) 
P388D1(淋巴瘤细胞) 
P3X63Ag8.653(骨髓瘤细胞) 
YAC-1(淋巴瘤细胞) 
P3X63Ag8(骨髓瘤细胞) 
EL4. IL-2(淋巴瘤细胞) 
SP2/0(骨髓瘤细胞) 
EL4(淋巴瘤细胞) 
P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1](骨髓瘤细胞) 
PIEC(猪髋动脉内皮细胞) 
CRFK(猫肾细胞) 
EBTr (NBL-4)(牛胚气管细胞) 
F81(猫肾细胞) 
Mv.1.Lu(NBL-7)(貂肺上皮细胞) 
MDCK (NBL-2)(狗肾细胞) 
RF/6A(猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞 ) 
MDBK (NBL-1)(牛肾细胞) 
LLC-MK2(恒河猴肾细胞) 
B95-8(EBV 转化的绒猴白细胞) 
Vero(非洲绿猴肾细胞) 
COS-7(SV40 转化的非洲绿猴肾细胞) 
CV-1(非洲绿猴肾细胞) 
COS-1(SV40 转化的非洲绿猴肾细胞 ) 
293 [HEK-293] (人胚肾细胞) 
HBL-100(整合SV40 基因的乳腺上皮细胞) 
CGM1(EB 病毒转化的B 细胞) 
WISH(羊膜细胞) 
HL-7702(肝细胞) 
Ha Fe(羊膜细胞) 
QSG-7701(肝细胞) 
HFL-I(MEMα)(胚肺成纤维细胞) 
HeLa [ Chang Liver ](张氏肝细胞) 
V79-4(中国仓鼠肺细胞) 
CHL/IU [ CHL-11 ](中国仓鼠肺细胞) 
CHO(中国仓鼠卵巢细胞) 
BHK(幼仓鼠肾细胞) 
R 1610(中国仓鼠体细胞) 
BRL 3A(大鼠肝细胞) 
NRK(大鼠肾细胞) 
L929(成纤维细胞) 
Y1(肾上腺皮质细胞) 
CTLL-2(T细胞) 
BALB/3T3(BALB/C小鼠胚成纤维细胞) 
Ana-1(巨噬细胞) 
SRSV/3T3(SRSV转化的3T3细胞) 
3T6-Swiss albino(胚胎成纤维细胞) 
PA317(成纤维细胞) 
3T3-Swiss albino(胚胎成纤维细胞) 
Mo-MuLv/3T3(Mo-MuLv感染的3T3细胞) 
MRC-5(胚肺细胞) 
WI-38(胚肺细胞) 
FRhK-4(恒河猴胚肾细胞) 
VERO C1008 (E6)(非洲绿猴肾细胞) 
Pt K1 (NBL-3)(长鼻袋鼠肾细胞) 
L1210(白血病细胞) 
Neuro-2A(脑神经瘤细胞) 
PC-12(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞) 
HeLa(宫颈癌细胞) 
A549 [A-549](肺癌细胞) 
MCF7(乳腺癌细胞) 
Hep 3B2.1-7(肝癌细胞) 
MDA-MB-231(乳腺癌细胞) 
Hep G2(肝癌细胞) 
HCT 116(结肠癌细胞) 
22RV1(前列腺癌细胞) 
HT-29(结肠癌细胞) 
KG-1(白血病细胞) 
LoVo(结肠癌细胞) 
THP-1(单核细胞白血病) 
SW620(结肠癌细胞) 
SK-N-SH(神经母细胞瘤细胞) 
SH-SY5Y(神经母细胞瘤细胞) 
COLO 205(结肠癌细胞) 
T/G HA-VSMC(人主动脉血管平滑肌细胞） 
HUVEC（人脐静脉血管内皮细胞） 
A10(大鼠主动脉血管平滑肌细胞) 
3T3-L1(小鼠脂肪细胞) 
A9(皮下结缔组织细胞) 
WEHI 22.1(B淋巴细胞 ) 
NIH/3T3(胚胎成纤维细胞) 
MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠原成骨细胞) 
L6(大鼠成肌细胞 ) 
H9c2(2-1)(大鼠心肌细胞) 
RSC96(大鼠雪旺细胞) 
CHO/dhFr-(中国仓鼠二氢叶酸还原酶缺陷细胞) 
Lec1(卵巢细胞) 
293T/17 [HEK 293T/17] (人胚肾细胞) 
AAV-293( 胚肾细胞 ) 
hFOB 1.19(SV40 转染成骨细胞) 
CCD-1095Sk(皮肤细胞 ) 
Hs 578Bst(乳腺细胞) 
NK-92(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞) 
NK-92MI(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞) 
HMy2.CIR(人B 淋巴母细胞) 
OK(负鼠(opossum)肾细胞) 
FO(骨髓瘤细胞) 
RAW 264.7(单核巨噬细胞白血病) 
P19(畸胎癌细胞) 
C6(胶质瘤细胞) 
RBL-2H3(白血病细胞) 
SiHa(子宫颈癌细胞) 
MG-63(骨肉瘤细胞) 
HEC-1-B(子宫内膜腺癌细胞) 
SW1353(骨肉瘤细胞) 
ES-2(卵巢透明细胞癌细胞) 
Saos-2(成骨肉瘤细胞) 
MDA-MB-468(乳腺癌细胞) 
SK-MES-1(肺鳞癌细胞) 
MDA-MB-435S(乳腺癌细胞) 
NCI-H661(大细胞肺癌细胞) 
ZR-75-1(乳腺癌细胞) 
NCI-H292(肺癌细胞（淋巴结转移）) 
Hs 578T(乳腺癌细胞) 
U-937(组织细胞淋巴瘤细胞) 
CFPAC-1(胰腺癌细胞) 
A3(淋巴细胞白血病细胞) 
PANC-1(胰腺癌细胞) 
Jurkat,Clone E6-1(T 淋巴细胞白血病细胞) 
SK-HEP-1(肝癌细胞) 
HL-60(急性粒细胞白血病细胞) 
HCCLM3(肝癌细胞) 
TT(人甲状腺癌细胞) 
PLC/PRF/5(肝癌亚力山大细胞) 
SW579(人甲状腺癌细胞) 
RKO(结肠腺癌细胞) 
FaDu(人咽鳞癌细胞) 
NCI-N87(人胃癌细胞) 
DT40(鸡淋巴瘤细胞)