酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中zui常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

       一、工作浓度的选择

　　在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

　　酶标记抗体的滴定方法是：将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。

　　其步骤为：先将抗原（或抗体）用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H_２SO_４ 0.05ml终止反应。

　　结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率zui大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。

　　有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。

　　要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的zui适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到zui适的实验条件。

    二、酶制剂及其底物

　　凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：（1）来源方便，易于纯化；（2）比活性高，性质稳定；（3）酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

　　由于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以zui常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的zui适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白zui大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（zui高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

　　HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H₂O₂）和供氢体（DH₂）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反应的过程如下:

　　　　　　　　　　　　　　　HRP

　　　　　　　　　DH₂＋H₂O₂────→D＋2H₂O

　　供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB（3.3－二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。S（5-氨基水杨酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。

　　由于HRP的底物H₂O₂本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H₂O₂不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

   三、HRP标记抗体的方法

　　酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

　　戊二醛二步法

　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

　　2.　标记步骤：

　　（1）　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

　　（2）　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

　　（3）　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

　　（4）　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。

　　（5）　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

　　（6）　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

　　（7）　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

　　（8）　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

　　3.　结果判定：

　　（1）　定性及效价滴定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。zui后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（ 见本节 （三）工作浓度的选择）。

　　（2）　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程1cm）。

　　酶量（mg／ml）＝OD403nm×0.4

　　IgG量（mg／ml）＝OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62

　　　　　　　　　酶量（mg／ml）　　 IgG量（mg／ml） 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

　　　（3）　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。

　　4.　试剂及器材：

　　（1）　0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水（PBS）：取0.2M Na₂HPO₄ 49ml, 0.2M NaH₂PO₄ 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。

　　（2）　1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。

　　（3）　1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

　　（4）　0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。

　　（5）　0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。

　　（6）　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

　　（7）　萘氏试剂及聚乙二醇（PEG，MW2000）。

　　（8）　纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。

　　（9）　HRP（RZ>3.0）。

　　（10） Sephadex G-25层析柱（2cm×50cm）。

　　（11） 搅拌器，分光光度计，离心机。

　　（12） 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。

   简易过碘酸钠法

　　本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前zui常用的方法。

　　1.　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO_４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO_４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH_４（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。

　　2.　标记步骤:

　　（1）　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

　　（2）　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。

　　（3）　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

　　（4）　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG（抗体，或SPA5mg）在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。

　　（5）　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。

　　（6）　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。

　　其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的（6）、（7）、（8）。

　　3.　结果判定：

　　除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

　　IgG量（mg／ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.62

　　4.　试剂及器材:

　　（1）　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠（广州化学试剂厂，批号830602）溶于蒸馏水10ml中。

　　（2）　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:

　　0.2M NaAc （1.361克／50ml） 3.7ml

　　0.2M HAc （0.601ml／50ml） 6.3ml

　　加蒸馏水至2,000ml。

　　（3）　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:

　　　　　　　Na２CO３ 0.32克

　　　　　　　NaHCO３ 0.586克

　　　　　　　加蒸馏水至50ml

　　再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。

　　（4）　NaBH４溶液（4mg／ml）:

　　临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。

　　（5）　其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

     四、注意事项

　　1.　在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高（zui低1∶16）,纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。

　　2.　所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。

　　3.　室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。

　　4.　浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。