士锋生物GST融合蛋白的表达与纯化介绍

GST融合蛋白的表达与纯化原理

GST 纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1）2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2）0.1ml 0.5ml EDTA 3）0.292g NaCl4）0.5ml Triton X-100 5）0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1）0.615g glutathione 2）10 ml 1M Tris，pH8.0 3）90ml distilled water .

GST融合蛋白的表达与纯化操作步骤

1）挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ）

2）37℃振摇至OD600值约为0.6

3）将2ml菌液加入100 ml LB中

4）37℃振摇至OD600值约为0.6

5）加入IPTG至终浓度为1mM

6）继续摇3～4h

7）离心（5000 rpm，5min，4℃）

8）用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌

9）超声破碎细胞

10）离心（12,000rpm,15min,4℃），取上清

11）用滤纸过滤

12）加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱

13）5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

14）样品过柱

15）5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

16）3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白

17）收集蛋白：0.5ml/管 18）取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂，防止蛋白的降解。