高性价比--人（Human）抗内皮细胞抗体（AECA） ELISA试剂盒

 使用说明书

检测原理

试剂盒采用双抗原一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预

先包被人抗AECA抗原的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测

抗原，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的

催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪

在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF值相比较，从而判

定标本中人抗内皮细胞抗体（AECA）的存在与否。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞

刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地

分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟

取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于

-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20 分钟。从冰箱取出的

浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解

后再使用。

2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。3. 预处理后的样本无需稀释，直接取50μL 加样即可。

4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称96孔配置48孔配置备注

微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无

阴性对照0.5mL 0.5mL 无

阳性对照0.5mL 0.5mL 无

检测抗原-HRP 10mL 5mL 无

20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释

底物A 6mL 3mL 无

底物B 6mL 3mL 无

终止液6mL 3mL 无

封板膜2 张2 张无

说明书1 份1 份无

自封袋1 个1 个无

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20 稀释，即1 份的20×洗涤缓

冲液加19 份的蒸馏水。

洗板方法

1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min 后甩尽

孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5 次。

2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。

操作步骤

1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封

袋密封放回4℃。

2. 设置阴、阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照、

阳性对照各50μL；

3. 待测样本孔加待测样本50μL；

4. 随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）

标记的检测抗原100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温

箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去

洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm 波长处测定各孔的

OD 值。

结果判断

1. 试验有效性：阳性对照孔OD 值平均值≥1.00；

阴性对照孔OD 值平均值≤0.15。

2. 临界值（Cut off）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

3. 阴性判断：样品OD 值＜临界值（Cut off），样品为阴性

4. 阳性判断：样品OD 值＞临界值（Cut off），样品为阳性

试剂盒性能

1. 准确性：阳性对照孔OD 值平均值≥1.00；阴性对照孔OD 值平均

值≤0.15，说明试验结果有效。

2. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

4. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

5. 有效期：6 个月

免责声明

1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所

产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者

承担。