脾细胞及骨髓瘤细胞制备操作步骤

 准备：

培养基A：RPMI1640 + 2mmol/L 谷氨酰胺+ 1mmol/L丙酮酸钠+ 1 mmol/L非必需氨基酸+青霉素100U/ml, 链霉素100 µg/ml（有的实验室也加入10%NCTC109 培养基）

培养基B：培养基A +3% FCS （见后说明）

培养基C：培养基A + 1× HAT + 20% FCS（500ml）

50 × HAT液或粉剂（有商品）

PEG1500 （有商品，可即用）

1mol/L硫酸铜液

17mol/L NH4Cl 水溶液（消毒，用于红细胞溶解）

培养皿（直径100或60mm）

细胞粗滤器（筛孔：40 µm ）

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骨髓瘤细胞必须培养至少一周，要求在融合日要达到对数生长期。所有的实验操作均需在消毒条件下进行。

脾细胞制备

1．分离取出脾脏，置于含7ml培养基B的培养皿中（在动物房进行），将培养皿移入垂直气流的通风橱中；

2．将脾脏移入另一含7ml培养基A的培养皿中，用镊子撕开脾脏，使大多数脾细胞释出；

3．用吸管吹打细胞团块，将混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4℃沉降5min；

4．将细胞悬液移入另一50ml聚丙乙烯管， 200 × g 离心7min，弃上清；

5．用冰冷的0.17mol/L NH4Cl 水溶液（2-3ml/ 每个脾脏）悬起沉淀，在室温下培养5-10 min，以溶解红细胞，然后缓慢加入45ml培养基A；

6．200 × g 离心7min，弃上清；

7．沉淀再悬入10ml 培养基A中。

骨髓瘤细胞的制备

1．在对数生长期收获107-108的骨髓瘤细胞；

2．200 × g 离心7min，弃上清；

3．轻轻震动试管以松动沉淀，将细胞悬于20ml 培养基A中；

4．200 × g 离心7min，弃上清；

5．细胞悬于10 ml 培养基A中，取适量进行细胞计数；

6．200 × g 离心7min，弃上清；

7．沉淀再悬于10 ml 培养基A中。

通过细胞融合得到B细胞杂交瘤

1．以2：1混合脾细胞与骨髓瘤细胞；

2．加入培养基A到25ml；

3．在室温下，200 × g 离心7min，弃上清；

4．轻轻震动试管使松动沉淀，后置入37℃水浴；

5．用1000µl的加样器，缓慢（超过1min）逐滴加入700µl经37℃预温的PEG1500，并用吸头搅拌；

6．经过1 min后，缓慢（超过3min）加入5ml培养基A；

7．再过1 min ，加入7ml 37℃预温的培养基A；

8．隔1 min，再加入7ml 37℃预温的培养基A（以达逐步稀释）；

9．室温下，200 × g 离心10min，弃上清；

10．再将沉淀小心地悬浮于培养基C，使细胞终浓度为1 × 106 脾细胞/ml；

11．在已加100 µl培养基C/孔的2-3块96孔板中，再加入100 µl/ 孔细胞悬液；

12．置入含5-8%CO2的37℃培养箱中；

13．一周后，每孔吸出100 µl上清，再加入100 µl培养基C，继续每周换液1-2次；

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