封闭剂在细胞免疫荧光中的应用步骤

I、步骤：

一、固定：

PBS 5min×3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。

固定液覆盖细胞，RT 静置15min。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

二、通透化：

通透液覆盖细胞，RT 静置30min。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

三、封闭：

封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：

一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。

4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

五、二抗孵育：

FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

六、染核：

新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。

PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

七、封片：

在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。

八、镜检，4℃避光保存。

II、注：

1、细胞密度要合适，状态较好。

2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。

3、完成后及时镜检，照相;分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。

III、试剂配制：

1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：

4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至*溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %（v/v）TritonX-100/PBS

3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS;或商品化封闭液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片剂：50%（v/v）甘油/PBS。