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大鼠孕激素ELISA KiT

来源:上海源叶生物科技有限公司   2009年12月30日 09:02  

产品编号: EIA06951
使用前*阅读说明书。本酶联免疫试剂盒是基于经典酶联夹心技术原理,能测量大鼠孕激素,只能用于研究用途,不得用于医学诊断。

工作原理
孕激素主要由黄体产生,故又叫黄体酮。孕激素通常要在孕激素作用的基础上才能发挥其作用。孕激素的主要作用,是促进子宫内膜特别是腺体的增长,为接纳受精卵做好准备,如受精卵着床后,使胚胎继续发育。对子宫内膜癌及增生过度的内膜腺体,孕激素则能使之萎缩退化。此外还能抑制子宫收缩,并减弱子宫对催产素的敏感性,使子宫活动减少,而起保胎作用。同时还与孕激素一起使乳腺发育,为产乳作好准备。所提供的ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体也为多克隆抗体,经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。

每套试剂盒中内容(96T)

材料 数量
标准品 2vial
预包被抗体的96孔板 96T ( 8×12)
生物素标记抗体 96T (1:100)
ABC(过氧化物酶标记亲和素) 96T (1:100)
样品稀释液 96T
抗体稀释液 96T
ABC稀释液 96T
TMB显色液A 96T
TMB显色液B 96T
TMB终止液 96T
ELISA洗涤液 96T(1:25)


需要而未提供的试剂和器材
1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 自动洗板机。
4. 单通道或多通道可调节移液器以及其吸头。
5. 蒸馏水,容量瓶等
6. 干净的试管和Eppendof管。

注意事项
1. 从-20℃取出的试剂盒,在4℃解冻过夜。盒内每一瓶解冻的溶液在开启瓶盖之前都要轻轻摇匀,避免解冻时出现的分层,否则会出现浓度不均一的现象。
2. 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
3. 配制各种试剂时,切记混匀!
4. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
5. 建议所有标准品、样本都做双份检测。
6. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活!
7. 为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液,室温凝固2小时或4℃过夜,离心1000×g 10分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

样品稀释的一般原则
用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量,决定适当的稀释倍数,以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的*检测范围。样品的稀释应有详细记录。

试剂的准备和保存
A. 标准品的稀释和使用:在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液,*溶解后取出250ul加入到750ul样品稀释液中,混匀后做倍比稀释。
稀释后的标准品在2小时内使用。

B.生物素标记抗体工作液:在使用前2小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul生物素标记抗体加抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

D. TMB工作液的准备:在使用前1小时内准备。取TMB显色液A 9份加TMB显色液B 1份,混匀后即为TMB工作液,切忌TMB工作液要避光保存,使用的过程中,避免接触金属器械。

操作程序
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
2. 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3. 酶标板加上盖,37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5. 将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次,每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液,37℃避光反应,反应过程中,要经常的观察,当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显时,即可加入TMB终止液0.1ml/孔。(显色反应zui长不要超过30分钟)。
10. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。

操作程序总结:
准备试剂,样品和标准品

加入准备好的样品和标准品,37℃反应90分钟

洗板2次,加入生物素化抗体工作液,37℃反应60分钟

洗板3次,加入ABC工作液,37℃反应30分钟

洗板5次,加入TMB显色液,37℃反应

加入TMB终止液

30分钟之内读OD值

计算标本待测因子含量

检测范围:500nmol/L→7.8 nmol/L。
敏感性: <2 nmol/L
特异性: 系统和其它细胞因子无交叉反应。
保存: -20℃ [短期内(如两周)可4℃]
有效期: 12个月(-20℃)。
用途: 用于体外定量分析液体标本(通用型)。

REFERENCES
1、 Noguchi, M.et al.(1993) Science 262:1877.
2、 Kondo, M.et al.(1993) Science 262:1874.
3、 Hilton, D.J.et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:497.
4、 Lin, J-X.et al.(1995) Immunity 2:331.
5、 Zurawski, S.M.et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:13869.
6、 Fanslow, W.C.et al.(1990) Cytokine 2:398.
7、 Fernandez-Botran, R.et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4202.
8、 Ruhl, S.et al.(1993) Cytokine 5:144.
9、 Yokata T.et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5894.
10、 Zurawski, G. and J.E. de Vries (1994) Immunol. Today 15:19..

 

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