产品编号：EIA05877
使用前*阅读说明书。本酶联免疫试剂盒是基于经典酶联夹心技术原理，能测量大鼠OPN，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

工作原理
骨桥素Osteopontin，OPN，又名Eta-1，是一种分泌型多功能糖蛋白。其可能功能包括骨代谢、免疫调节、伤口愈合、细胞存活和肿瘤的发展。OPN主要由骨、肾、上皮组织合成。OPN在体内合成时，前体有314个氨基酸，成熟蛋白质298个氨基酸，呈酸性。由于糖化程度不同，分子量从33-75KDa。所提供的ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体也为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。

每套试剂盒中内容（96T）

材料 数量
标准品 96T（2vial）
预包被抗体的96孔板 96T（8×12）
生物素标记抗体 96T （1:100）
ABC（亲和素-过氧化物酶复合物） 96T （1:100）
样品稀释液 96T×2
抗体稀释液 96T×1
ABC稀释液 96T×1
TMB显色液A 96T×1
TMB显色液B 96T×1
TMB终止液 96T×1
ELISA洗涤液 96T×1（1:25）

需要而未提供的试剂和器材
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 自动洗板机。
4． 单通道或多通道可调节移液器以及其吸头。
5． 蒸馏水，容量瓶等
6． 干净的试管和Eppendof管。

注意事项
1． 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
2． 配制各种试剂时，切记混匀！
3． 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
4． 建议所有标准品、样本都做双份检测。
5． 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活！
6． 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液，室温凝固2小时或4℃过夜，离心1000×g 10分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

样品稀释的一般原则
用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的*检测范围。样品的稀释应有详细记录。

试剂的准备和保存
A. 标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液，*溶解后做倍比稀释。
稀释后的标准品在2小时内使用。

B．生物素标记抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素标记抗体加抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

D TMB显色工作液的准备：在使用之前30分钟，按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比例配制TMB显色工作液。

操作程序
1． 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
2． 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3． 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5． 将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9． 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应zui长不要超过30分钟）。
10． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

操作程序总结：
准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品和标准品，37℃反应90分钟

洗板2次，加入生物素化抗体工作液，37℃反应60分钟

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟

洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应

加入TMB终止液

30分钟之内读OD值

计算标本待测因子含量

检测范围：10000pg/ml→156pg/ml。
敏感性： ＜10pg/ml
特异性： 系统和其它细胞因子无交叉反应。
保存： -20℃ [短期内（如两周）可4℃]
有效期： 12个月（-20℃）。
用途： 用于体外定量分析液体标本（通用型）。

REFERENCES
1． Asou, Y.et al.（2001） Endocrinology 142:1325.
2． Boskey, A.L. et al.（2002） Calcif. Tissue Int. 71:145.
3． Boskey, A.L. et al.（1993） Bone Miner. 22:147.
4． Hunter, G.K. et al.（1994） Biochem. J. 300:723..
5． O’Regan, A.W. et al.（2000） Immunol. Today 21:475.
6． Denhardt, D.T.et al.（2001） J. Clin. Invest. 107:1055.
7． Weber, G.F. et al.（2002） J. Leukoc. Biol. 72:752.
8． Giachelli, C.M. et al.（1998） Am. J. Pathol. 152:353.
9． O’Regan, A.W.et al.（2000） J. Leukoc. Biol. 68:495.
10． Ashkar, S. et al.（2000） Science 287:860.