(一)抗原抗体反应
根据RIA原理,将未标记抗原(标准品和待测样品)、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中,在一定条件(温度、时间及介质pH)下进行竞争抑制反应;为取得*实验效果(如灵敏度及检测浓度范围),上述三种主要试剂可同时反应(平衡法),也可采用非平衡法,先加待测样品(或标准品)和抗血清,使非标记抗原与抗体达到结合平衡,然后再加入标记抗原竞争与抗体结合。此外,反应温度和时间可依据具体待检抗原的特性和所用抗体亲和力(K值)大小等条件进行选择。若抗原性质稳定且含量高,反应时间可较短(数小时),反应温度可选室温或37℃;若抗原的理化性质不稳定(如某些小分子肽)或含量甚微、或抗体的K值较低,则应选低温(4℃)长时间(20~24h)反应条件。
剂量-反应(竞争—抑制)曲线图
(二)分离结合与游离标记物
RIA反应平衡后,标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物(B)。由于其含量极少,不能自行沉淀,因此需加入适当的沉淀剂才能将其*沉淀,然后经离心使其与游离的标记抗原(F)分离。某些小分子抗原,也可采用吸附法分离B与F。
B、F分离步骤所造成的误差是RIA实验误差的重要组成部分,可影响方法的灵敏度和测定的准确性。理想的分离方法应分离*,迅速;分离试剂和过程不影响反应平衡,而且效果不受反应介质因素的影响;操作应简单、重复性好以及经济。
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