HPLC测定乳糖酸红霉素的含量

乳糖酸红霉素是红霉素的乳糖醛酸盐，主要抗菌活性为乳糖酸红霉素A和含有一定活性的乳糖酸红霉素B、C 。《中国药典2000年版采用微生物检定法进行含量测定 ，英国药典和欧洲药典均采用HPLC 。鉴于微生物检定法影响因素较多，故采用液相色谱测定乳糖酸红霉素含量的方法。红霉素A（96。...
   乳糖酸红霉素是红霉素的乳糖醛酸盐，主要抗菌活性为乳糖酸红霉素A和含有一定活性的乳糖酸红霉素B、C 。《中国药典2000年版采用微生物检定法进行含量测定 ，英国药典和欧洲药典均采用HPLC 。鉴于微生物检定法影响因素较多，故采用液相色谱测定乳糖酸红霉素含量的方法。
1 实验部分
1．1 仪器与试药
LC—lOAD HPLC和SPD—IOA紫外检测器（日本岛津）。红霉素A（96.7％）、红霉素B（99.0％）、红霉素C（97.3％）对照品（Council of Europe europenpharmacopoeia，BP 907一F67029 straspourg CEDEX1）；N一去甲基红霉素A对照品（中国药品生物制品检定所）；注射用乳糖酸红霉素（大连美罗大药厂）；乙腈、甲醇为色谱纯。
1．2 方法与结果
1．2．1 色谱条件
Hypersil BDS色谱柱（4.6 mln×200 min，5 ，大连依利特科学仪器有限公司），流动相为0.01 mol/L 磷酸氢二钾一乙腈（60：40）；稀释液为pH 7.0磷酸盐缓冲液一甲醇（15：1）；检测波长215nm；流速1.0 ml/min；柱温35℃ ；进样20μL。
1．2．2 对照品溶液的配制
    精密称取红霉素A对照品51.0 mg、红霉素B、C对照品2.5 mg和N一去甲基红霉素A 2.5 mg置25 ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液作为对照品溶液。进样20μL进行测定。
1．2．3 线性关系
    精密称取红霉素A对照品适量（相当于红霉素25 mg），置10 ml量瓶中，加稀释液至刻度，摇匀，滤过。精密量取上述溶液l、2、5、10、20、40、80、100μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对浓度（mg/ml ）绘制标准曲线。其回归方程为：A ：98.98c一13.26（r=0.9999），表明红霉素在0.125～l2.5 ?g/ml 的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
1．2．4 溶液稳定性试验
    取“1．2．7”项下的溶液。在0、2、5 h测定主峰面积，结果在5 h内峰面积无变化，溶液较稳定。
1．2．5 回收率试验
    考虑到样品中可能存在游离的乳糖酸，为了考察其对含量测定的影响，按“1．2．7”项下浓度的80％、100％、120％精密称取乳糖酸红霉素各两份，按工艺配比加入适量乳糖酸钠辅料，分别置25 ml量瓶中，加入稀释液溶解，至刻度，摇匀，滤过，照“1．2．7”项下方法测定含量，计算回收率。结果辅料对测定无干扰。
1．2．6 方法精密度按“1．2．7”项下方法，对同一批号样品，分别取样平行测定5次，求得含量的RSD=1.6l％，表明分析方法精密度较好。
1．2．7 样品的测定
    取样品适量，精密称定，加稀释液制成含红霉素2.0 mg/ml 的溶液。作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪。另取红霉素A、B、C对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，3批样品的含量测定按干燥品以乳糖酸红霉素计，其结果分别为93.8％ 、94.1％和93.7％。
2 讨论
    文中试验主要以乳糖酸红霉素A计算，含量测定结果为乳糖酸红霉素A、B、c的总含量 英国药典（2000版）所用色谱柱为PLPP 100A，成本较高，国内较少使用。试用ODS柱，因叔丁醇黏度大，柱效下降很快，所以，采用Hypersil BDS 4.6 mm×200mm色谱柱，各峰间分离度等系统适用性均达到了英国药典的要求。在试验中也发现，由于流动相系统pH
为9.2，缓冲液仅为0.01 mol/L 磷酸氢二钾，因此，流动相的缓冲容量很低，对色谱柱填料的溶解度较高，使得该方法的耐用性较差。