实验开始注意事项：各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在 37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 （参照说明书）

加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl，余孔分别加标准品或待测样品 100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液 A工作液  100μl（在使用前一小时内配制） ，酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡 1-2分钟，大约 400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干） 。 （参照说明书）

加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在 10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。 （参照说明书）

孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔 中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。

试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液 A工作液、检测溶液 B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10μl） ，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液 A工作液或检测溶液 B工作液。（请参照说明书）

反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔 10 分钟） ，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

底物注意事项：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
 

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板方法：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
 

 
以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标） ，OD 值为横坐标（对数坐标） ，在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。  （参照说明书）
 

备注:在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

试剂盒保存：短期（1周以内）以标签上的标示为准，长期保存请将试剂全部保存于-20℃。

标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
           2.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.具体操作参照说明书。

计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项:试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

注意事项:浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

注意事项:各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

注意事项:请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔*孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。（具体请参照说明书）。

试剂盒组成：（参照说明书及实物）
1 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1瓶
2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品（160ng/L） 0.5ml×1瓶
3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶
4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1份
5 显色剂A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2张 
6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个