摘要:机体免疫功能受抑制时,单核细胞或巨噬细胞内潜伏的或持续存在的人类巨细胞病毒(HCMV)感染会重新激活。我们研究了甘草甜素,环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α对U-937细胞和MRC-5细胞中感染的人类巨细胞病毒(HCMV)的病毒DNA合成和抗原表达的作用。虽然在本研究中,根据流式细胞仪和免疫荧光分析的结果,甘草甜素对人类单核细胞系U-937细胞和人类胚胎肺细胞系MRC-5细胞中的人类巨细胞病毒(HCMV)的抗原表达都有抑制作用,用聚和酶链式反应方法仍可检测到超早期的人类巨细胞病毒(HCMV)DNA。环孢霉素A,和肿瘤坏死因子对U-937细胞和MRC-5细胞中感染的人类巨细胞病毒(HCMV)没有抑制作用。U-937细胞和MRC-5细胞中人类巨细胞病毒(HCMV)感染的模型不仅有助于阐明持续感染的机制,而且也有助于阐明抗人类巨细胞病毒(HCMV)的化学因子的作用机制。J.Leukoc.Biol.55:24-28;1994。
关键词:巨细胞病毒,甘草甜素,U-937细胞,MRC-5细胞,聚和酶链式反应
引言
虽然人类巨细胞病毒(HCMV)感染在人的一生中任何时候均会出现,每次感染的临床特征却各不相同。人类巨细胞病毒(HCMV)感染zui常见的是引起先天的和围生期的感染,但它在输血获得性感染方面也占重要地位,在器官移植病人,接受免疫移植剂化疗的病人,接受大剂量皮质醇激素治疗的病人,或人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的患者的发病率和死亡率方面也有举足轻重的作用〔1〕。巨细胞病毒原发感染通常是个良性的过程,但是从此病毒就会在宿主细胞中潜伏下来或持续存在。一旦宿主的免疫功能受抑制时,这些潜伏或持续的感染就会被重新激活,产生多种多样的临床表现。单核-巨噬细胞系的细胞似乎是人类巨细胞病毒(HCMV)潜伏或持续感染的主要场所〔2,3〕。但是,在体外很难使人类巨细胞病毒(HCMV)感染单核细胞和巨噬细胞。在无症状的病毒携带者的外周血细胞中,检测不到巨细胞病毒的基因表达〔4-6〕。我们成功地使该病毒的AD169株感染了人类单核细胞系U-937细胞,并获得了一个人类巨细胞病毒(HCMV)的临床分离株〔7〕。为了研究抗巨细胞病毒因子对人类巨细胞病毒(HCMV)感染的U-937细胞中病毒重新激活的抑制作用。因此,我们研究了甘草甜素,环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α对U-937细胞和MRC-5细胞中感染的人类巨细胞病毒(HCMV)的病毒DNA合成和抗原表达的作用。
缩写:ATCC,American Type Culture Collection;CMV 巨细胞病毒;CsA 环孢霉素A;EA 早期抗原;GL甘草甜素;HCMV 人类巨细胞病毒;HIV-1 ,人类免疫缺陷病毒1型;HLA,人类白细胞抗原;IEA,超早期抗原;IFA,免疫荧光分析;IgG,免疫球蛋白G;LA晚期抗原;mAb,单克隆抗体;MOI,多重感染指数;PBS,磷酸盐缓冲液;PCR,聚和酶链式反应;PKC,蛋白激酶C;TNF-α,肿瘤坏死因子-α;VZA,水痘-带状疱疹病毒
重印许可:日本,Hokkaido,Sapporo 医科大学,临床医学院,儿科系
材料和方法
细胞系和人类巨细胞病毒(HCMV)的扩增:
U-937细胞单核细胞系是从美国类型培养样品库(American Type Culture Collection,ATCC)获得的,并于加有10%加热灭活的胎牛血清、
69实验室株。这一病毒在人类胚胎肺细胞(MRC-5细胞)中进行扩增,采集为细胞相关的。人类巨细胞病毒(HCMV)的计数通过MRC-5细胞的噬菌斑分析而获得。为了增加感染率,我们将5x105U-937细胞用聚凝胺(2ug/ml)置于5mlRPMI培养基中预处理20分钟。然后将细胞进行离心分离,并重新悬浮于0.5ml无细胞的AD169病毒株中以1.0的多重感染指数(MOI)维持三小时。然后将细胞进行再次离心,以除去未结合的病毒,用新鲜培养基冲洗三遍后再次进行离心,然后再次悬浮于新鲜培养基中。在24小时的间隔期内,细胞受到病毒攻击,并在新鲜培养基中再次悬浮。在其中的一些实验中,培养基中含有不同浓度的甘草甜素,环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α,下面将进一步解释。这样,在多种培养基中,多次进行离心和用新鲜培养基悬浮,使细胞得到清洗。0.1MOI的AD169株还被接种于1-打兰培养瓶中,后者带有
表面抗原的流式细胞仪分析:
细胞表面抗原的分析是通过流式细胞仪进行分析的,使用了下列结合有荧光素的单克隆抗体(mAbs):CD3,CD4,CD8,CD45R,Leu-15(Mac-1),Leu-Mi,HLA-DR,和免疫球蛋白G的Fc段(CA,Mountain View ,Becton Dickinson公司生产)。对每个样品都用相应的同位素特异的对照抗体进行分析。我们使用了对数-线性转换表对每个荧光色谱图与其对应的合适的荧光素标记的同位素对照(IgG1-FITC;Becton Dickinson公司生产)进行了比较。在染色过程中,使用了人类巨细胞病毒(HCMV)超早期抗原和晚期抗原的单克隆抗体(CA,Temecula,化工公司生产)。
药物:
甘草甜素由东京Minophagen 制药公司提供。用
通过聚和酶链式反应检测人类巨细胞病毒(HCMV)DNA
如前所述进行聚和酶链式反应(PCR)〔10〕。用SS-苯基-氯仿提取蛋白质后的,再用乙醇沉淀DNA。在聚和酶链式反应(PCR)中,我们使用了合成的单核苷引物来扩增人类巨细胞
图1. 甘草甜素对人类巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用。在AD169病毒株感染的MRC-5细胞的培养基中加入了不同浓度的甘草甜素。将细胞培育48小时后,免疫荧光显示人类巨细胞病毒(HCMV)的超早期抗原和早期抗原阳性的细胞数与对照细胞(培养基中不含甘草甜素)数进行比较。以免疫荧光显示含有甘草甜素的细胞数除以免疫荧光显示不含有甘草甜素的细胞数,所得结果即为细胞百分数。方块,圆圈和三角符号代表三组不同的实验。
病毒(HCMV)中编码主要超早期(IE)抗原(US3)的DNA序列。设计了下面的单核苷作为PCR的引物:PIE-1(5'CAAGAGAAAGATGGACCCTGAT3',核苷980-1001)。其序列和位点在AD169HindIII片断E上。用作探针的合成单核苷是用Milligan7500DNA合成仪制备的,并用高压液体组织化学摄影法纯化。CDNA,引物和试剂均在
结果
用IFA和PCR方法分析的甘草甜素,环孢霉素A和肿瘤坏死因子α对U-937细胞和MRC-5细胞中感染的人类巨细胞病毒(HCMV)的作用
用间接免疫荧光分析(IFA)方法分析可得,甘草甜素在1.0mg/ml的浓度时对AD169感染MRC-5细胞有抑制作用,在10.0mg/ml的浓度时则对AD169感染MRC-5细胞有*抑制作用(参见图1)。MRC-5细胞中甘草甜素的CD50是15.0mg/ml。图
对表面标记的的流式细胞仪研究:
本研究中,U-937细胞被分为两个主要的亚群(G1亚群和G2亚群),如前所述。培养三天后,按有或无甘草甜素分别分析U-937细胞表面的抗原表达。G1亚群中的细胞主要表达Leu-M1和HLA-DR,而另一亚群(G2亚群)的细胞主要表达CD4,CD45R,Leu-15,Leu-M1和HLA-DR。加入的甘草甜素浓度较低时(0.5mg/ml)时,CD4阳性的细胞数是降低的,而甘草甜素浓度较高时(1.5mg/ml)时,CD4阳性的细胞数是轻度升高的(结果未显示)。AD169病毒株接种的U-937细胞中的人类巨细胞病毒(HCMV)超早期抗原和晚期抗原
图2. (A) AD169病毒株感染的MRC-5细胞中的人类巨细胞病毒(HCMV)超早期DNA的扩增结果,其中培养基中含有不同浓度的甘草甜素。第I道和第II道显示的是未感染的MRC-5细胞和甘草甜素浓度为12.0mg/ml时的未感染MRC-5细胞的结果。第2,3,4,5,6,7,8,9道和第10道分别显示的是甘草甜素浓度分别为0,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,和12.0mg/ml时,巨细胞病毒(HCMV)接种的MRC-5细胞的扩增带。第12道和第13道分别显示的是阳性对照AD169病毒株DNA和分子量标记物的结果。(B)经过三天含甘草甜素0.5到2.5 mg/ml的培养基培养后 ,AD169病毒株感染的U-937细胞中的人类巨细胞病毒(HCMV)超早期DNA的扩增结果。第3,4,5,6,7,8,9道和第10道分别显示的是甘草甜素浓度分别为0,0.5,1.0,1.5,2.0,和2.5mg/ml时,巨细胞病毒(HCMV)接种的U-937细胞的扩增带。第2道和第9道分别显示的是未感染的U-937细胞和甘草甜素浓度为2.5mg/ml时的未感染U-937细胞的结果。第10道,第I道和第II道分别显示的是阳性对照(AD169病毒株DNA)和分子量标记物的结果。
通过标记单克隆抗体,以流式细胞仪技术检测,如表1所示。在两个组中,人类巨细胞病毒(HCMV)超早期抗原和晚期抗原都是通过标记单克隆抗体以流式细胞仪技术检测的,甘草甜素浓度均仅为0.5mg/ml。在含有甘草甜素的培养基中与AD169病毒株一起培育三天后,G1亚群的细胞数降低了,而G2亚群的细胞数则升高了。培养基中甘草甜素浓度高于1.0mg/ml时,用流式细胞仪技术对人类巨细胞病毒(HCMV)接种的U-937细胞中超早期抗原和晚期抗原均检测不到。对U-937细胞环孢霉素A的CD50是10.0ug/ml。10到1000U/ml的肿瘤坏死因子-α对有或无人类巨细胞病毒(HCMV)感染的MRC-5细胞的生存能力均无作用(数据未显示)。用环孢霉素A或肿瘤坏死因子处理后,U-937细胞表面抗原的表达与zui初未处理的U-937细胞没有差别。有或无AD169病毒株感染的U-937细胞表面抗原的表达也很类似,只是CD4+的细胞数不同。AD169病毒株感染的U-937细胞中,CD4+的细胞数稍微少一些。表2显示的是环孢霉素A或肿瘤坏死因子对人类巨细胞病毒(HCMV)AD169病毒株感染的U-937细胞(尤其是CD4+和CD8+细胞)的作用。环孢霉素A或肿瘤坏死因子对U-937细胞中的人类巨细胞病毒(HCMV)没有抑制作用。培养基中含环孢霉素A或肿瘤坏死因子时,在CD4+和CD8+的U-937细胞中可以检测到人类巨细胞病毒(HCMV)的超早期抗原。
讨论
虽然已经知道人类巨细胞病毒(HCMV)可以感染人类淋巴细胞中的T细胞和B细胞,自然杀伤细胞,和巨噬细胞,人类巨细胞病毒(HCMV)潜伏感染和持续感染的实际部位和再激活的机制仍有争议〔2,11-13〕。在一项原位杂交的研究中,结果显示在血清学阳性的健康个体的单核细胞和单个核细胞中检测到了病毒的核酸〔5〕。单核-巨噬细胞系被认为是人类巨细胞病毒(HCMV)潜伏感染的部位〔3〕。也有报道指出,单核细胞zui终分化为组织巨噬细胞对人类巨细胞病毒(HCMV)感染的进入是必要的〔3,14〕。U-937细胞中巨细胞病毒基因组的表达是多变的,这可能可以用细胞个体的差异来解释〔15〕。一些体外实验表明,人类巨细胞病毒(HCMV)在一些外周血单个核细胞中的复制只限于超早期蛋白的
表1.在有或无甘草甜素的培养基中培养72小时后,用流式细胞仪检测到的U-937细胞中人类巨细胞病毒(HCMV)抗原的表达。
甘草甜素 | 有或无AD169病毒株感染 | 超早期抗原阳性 | 晚期抗原阳性 |
无 | 未感染 | 检测不到 | 检测不到 |
| AD169病毒株接种 | 2.0+0.5% | 0.4+0.3% |
0.5mg/ml | 未感染 | 检测不到 | 检测不到 |
| AD169病毒株接种 | 1.3+0.2% | 0.2+0.1% |
1.5mg/ml | 未感染 | 检测不到 | 检测不到 |
| AD169病毒株接种 | 检测不到 | 检测不到 |
表2. 培养三天后,用流式细胞仪检测到的CD4+或CD8+的U-937细胞中人类巨细胞病毒(HCMV)超早期抗原(CD4+或CD8+细胞中超早期抗原阳性的百分数)。
U-937细胞 | CD4+ | CD8+ |
未感染 | 检测不到 | 检测不到 |
AD169病毒株感染 且无抗病毒因子 | 0.6+0.1% | 0.4+0.1% |
AD169病毒株感染 且含1.0mg/ml的甘草甜素 | 检测不到 | 检测不到 |
AD169病毒株感染 且含1.0mg/ml的环孢霉素A | 0.6+0.1% | 0.4+0.1% |
AD169病毒株感染 且含100U/ml的肿瘤坏死因子 | 0.6+0.1% | 0.4+0.1% |
表达〔5〕.通常,人类巨细胞病毒(HCMV)感染的巨噬细胞的上清液中不含病毒的后代。
用PCR法扩增DNA已经成功地运用于临床诊断中,以检测不同标本中的人类巨细胞病毒(HCMV)。然而,从本研究中可以看出,该系统应该更准确地定义为定量PCR,而不是定性PCR。在LA(HBLF4或US14)基因组附近的大量片断对于细胞培养中病毒的复制是非必须的〔16〕。Demmler等人〔17〕评价了设置两个引物,用于扩增人类巨细胞病毒(HCMV)的超早期抗原和晚期抗原基因的DNA。超早期产物是用来转换病毒基因组的,使其脱离受感染细胞中限制性表达的状态。人类巨细胞病毒(HCMV)可以与人类阴茎包皮中的成纤维细胞表面的一个受体特异地结合,结合能力中等〔18〕。虽然U-937细胞表面具有Fc和C3的受体,并且缺少表面及细胞内免疫球蛋白〔19,20〕,本研究并不能解释巨细胞病毒进入单核细胞是通过IgG的Fc段受体介导的。使用流式细胞仪技术,可以在CD4+和CD8+的U-937细胞中检测到巨细胞病毒的超早期抗原,正如前面一项对外周血淋巴细胞的研究中所述〔2〕。
目前已经有一些抗病毒因子,仅表现出抗病毒特异的代谢过程的活性,而没有细胞毒性。不幸的是,目前还没有发展针对巨细胞病毒感染的成功治疗。甘草甜素是一种抗炎物质,同时具有抗病毒活性〔21,22〕。而且,在日本已经声称甘草甜素对慢性活动性肝炎具有一定的治疗和预防作用。还有报道甘草甜素对单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒颗粒有灭活作用。甘草甜素还能抑制U-937细胞和MRC-5细胞中人类巨细胞病毒的复制。由于甘草甜素在感染96小时后加入仍有效,可能能抑制病毒从感染细胞中向未感染细胞中扩散(结果未显示)。甘草甜素还可对HIV-1的复制有剂量依赖性的抑制作用〔21,22〕。虽然蛋白激酶C(PKC)在HIV-1的复制过程中的确切作用尚且未得可知,但HIV-1病毒颗粒与细胞表面受体的结合似乎需要蛋白激酶C(PKC)的参与,因为CD4是由蛋白激酶C(PKC)进行磷酸化的〔23-25〕。
Baba和Shigeta认为,甘草甜素可以抑制水痘-带状疱疹病毒颗粒的穿透细胞,脱去衣壳,或释放过程。甘草甜素可能也是通过以上的某一项机制抑制人类巨细胞病毒在MRC-5细胞中的复制。根据间接免疫荧光分析,流式细胞技术和PCR技术检测结果的不同,通过用含有甘草甜素的培养基培养人类巨细胞病毒(HCMV)感染的U-937细胞和MRC-5细胞,病毒蛋白的合成和病毒在细胞间的扩散可能会受到影响。接受环孢霉素和其他药物免疫抑制治疗的患者存在严重人类巨细胞病毒(HCMV)感染的危险。环孢霉素还可能对HIV-1感染T淋巴细胞和在其内复制有抑制作用,可能是通过干扰病毒与特异的细胞受体的结合而起作用的〔27〕。除了对肿瘤细胞的细胞毒作用外,肿瘤坏死因子还有其他的一些生物学活性,比如抗病毒作用〔28〕。关于用甘草甜素对细胞进行预处理的研究正在进行中。
相关产品
免责声明
- 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。