样本质量对荧光定量检测有哪些影响?

来源：北京佰司特科技有限责任公司 2025年07月31日 16:16

样本质量是荧光定量检测（如qPCR、荧光定量免疫分析等）结果准确性的根基，其影响贯穿从核酸/蛋白提取到最终信号读取的全流程，核心问题集中在干扰检测体系、引入假阳性/假阴性或导致数据失真。具体影响及机制如下：

一、样本采集与保存不当：破坏目标物质稳定性

样本从采集到处理的每一步操作失误，都会直接影响目标分析物（核酸、蛋白等）的完整性或浓度。

降解问题：

核酸样本（如血液、组织）若未及时冷藏或添加稳定剂（如EDTA、RNA保存液），会因核酸酶（DNase、RNase）活性激活导致DNA/RNA断裂，qPCR中可能因引物无法有效结合而出现扩增效率下降，Ct值偏大甚至无扩增。

蛋白样本若反复冻融或高温保存，会因变性聚集失去抗原性，导致荧光免疫检测中抗体结合效率降低，信号强度偏低。

浓度偏差：

采集量不足（如血清量过少）或保存过程中蒸发，会导致目标物质浓度被高估（因溶剂减少）；而溶血、脂血样本（如红细胞破裂释放血红蛋白）会稀释目标物，造成浓度低估。

二、样本基质干扰：抑制检测反应或产生背景信号

样本中除目标物外的其他成分（基质）可能通过物理或化学作用干扰检测体系，尤其在未充分提纯的样本中更明显。

PCR抑制剂：

血液中的血红蛋白、胆红素，土壤中的腐殖酸，植物样本中的多酚类物质等，会通过螯合Mg²⁺（PCR酶辅因子）、吸附DNA聚合酶或直接破坏核酸结构，抑制扩增反应。例如，未纯化的全血样本直接扩增时，常出现Ct值延迟或扩增曲线异常（如平台期提前）。

荧光淬灭或增强：

某些基质成分（如深色色素、高浓度盐离子）会吸收或散射激发光，导致荧光信号被淬灭（信号偏低）；而脂质颗粒可能非特异性结合荧光染料（如SYBRGreen），产生背景荧光（假阳性信号）。

非特异性结合：

在荧光免疫检测中，样本中的杂蛋白可能与抗体交叉反应，或吸附在检测孔表面，导致背景信号升高，降低检测特异性。

三、样本前处理缺陷：引入误差或污染

前处理（如提取、纯化、稀释）是样本质量控制的关键环节，操作不当会放大误差。

提取效率低：

核酸/蛋白提取时若裂解不充分（如组织未彻底匀浆），会导致目标物回收率低，测量值低于真实值；而离心不彻底残留的杂质（如细胞碎片）会堵塞光路或干扰反应。

交叉污染：

处理多个样本时，若移液器污染、耗材重复使用或环境中存在扩增产物气溶胶，会导致样本间交叉污染，出现假阳性结果（尤其是qPCR检测低丰度目标时）。

稀释误差：

高浓度样本需稀释至检测线性范围内，若稀释倍数计算错误或混合不均，会导致结果偏离真实值（如10倍稀释操作失误变为5倍，结果被高估1倍）。

四、样本均一性差：导致重复检测结果波动

样本本身的物理不均一会使平行实验间差异增大，尤其对固体或半固体样本影响显著。

组织样本异质性：

肿瘤组织中癌细胞分布不均，若取样位置不同，目标基因（如癌基因）的表达量可能差异显著，导致重复检测的Ct值标准差增大（通常要求平行样Ct值差＜0.5，否则结果不可靠）。

悬浮样本沉淀：

细胞悬液、细菌培养液若未充分混匀，取样时目标物浓度随时间变化，会导致平行孔间信号差异超过允许范围（如CV值＞5%）。

凡本网注明“来源：化工仪器网”的所有作品，均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品，未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的，应在授权范围内使用，并注明“来源：化工仪器网”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
本网转载并注明自其他来源（非化工仪器网）的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品第一来源，并自负版权等法律责任。
如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。

联系我们