铬系星形聚合物：具有水溶性和隐身性能的短波红外发射荧光团

本文要点：短波红外（SWIR）区域的荧光成像已成为研究哺乳动物的重要工具。目前，聚甲炔染料在体内成像应用中的进展主要受限于疏水性和/或非特异性蛋白结合。本文采用方法结合亲水性与隐匿行为，通过精确设计的聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）星形聚合物结构构建高亮度短波红外发射色烯鎓荧光团，命名为色烯鎓星（或称"CStars"）。在聚合物屏蔽染料中，含五条POx链的变体（CStar30）具有显著增强的水溶性与短波红外亮度，可实现小鼠体内高分辨率短波红外成像；其体内展现的快速肾脏清除特性与隐匿行为还实现了淋巴系统无创可视化效果的提升。此外，CStar与FDA批准染料吲哚菁绿（ICG）促进双色激发复用短波红外成像，可在视频速率帧数下实时同步观测同一活体内的流体动力学与蛋白质动力学。

活体成像

本研究融合隐形聚合物与短波红外发射聚甲炔荧光团优势，采用精确设计的星形聚合物结构以保持造影剂的分子级离散性。星形聚合物以共同核心延伸出三条及以上聚合物链（"臂"）为特征，相比线性聚合物具有链缠结少、溶液粘度低等性质。通过在星形聚合物核心植入短波红外发射荧光团，推断聚合物臂既能提供水溶性和体内隐形特性，又可作为分子屏障保护水环境中的荧光团。由此开发出色烯鎓星形聚合物"CStars"：其核心为高亮度色烯鎓荧光团，外围延伸隐形亲水性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx）聚合物臂（图1B）。将该材料与吲哚菁绿（ICG）联用，最终实现小鼠体内双色激发复用短波红外成像，通过降低蛋白结合率显著改变体内生物分布与清除速率（图1C）。

图1. 用于体内成像的聚甲氧基荧光团

本研究选用具有优异短波红外亮度的七甲川色烯鎓荧光团（Chrom7）作为CStars核心。通过结构修饰，使核心色烯鎓骨架携带3-5个末端炔基，以便通过铜催化点击化学进行聚合物偶联。隐形聚合物臂选用叠氮功能化线性聚(2-甲基-2-噁唑啉)（POx），由对应单体聚合而成。本研究聚焦聚合度30的POx链，因其在胶束和纳米乳剂中展现亲水性。采用"耦合接枝"策略将核心荧光团与聚合物臂结合——先独立制备各组分再偶联，成功制得分子量分布狭窄的星形聚合物（图2A）。尽管大分子聚合物偶联动力学缓慢，但铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）在此展现出高效性。

图2. 点击化学法合成铬烯基星形聚合物（CStars）

为探究星形结构对染料性能的影响，制备了三种含不同炔基数目的核心荧光团。通过CuAAC反应高效合成了分子量分布极窄（Đ≤1.02）的CStars（5,6,7），分别含五臂、四臂及三臂POx链（图2B,）。以5号材料优化反应条件发现：当每炔基配2当量POx聚合物及16% Cu(I)催化剂时，反应数小时内即可转化。凝胶渗透色谱（GPC）、基质辅助激光解吸质谱（MALDI）（图2C-E）分析表明偶联反应高效稳定，不同批次产物重现性优异。随着聚合物臂数量减少，尺寸排阻色谱与透析分离难度增加，导致分离收率逐步降低。

图3. CStars和核心荧光团的光物理性质

在获得五臂、四臂及三臂CStars材料（5–7）后，选用极性更强的甲醇（MeOH）直接对比核心荧光团与CStars亮度。值得欣慰的是，所有CStars均保持聚甲炔特征吸收/发射光谱，且相较对应核心荧光团产生约10 nm红移（最大吸收波长λmax, abs∼ 940 nm）。核心荧光团亮度（ΦF X εmax）在所有CStars中也得以维持或提升（图3D）。这些数据共同表明：聚合物臂在改变核心荧光团溶解性的同时，能保留理想光物理特性。随后评估了CStars结构抑制非辐射聚集并传递亮度至水相的能力。浓度匹配实验显示：吸收光谱随臂数变化（图3A），而发射光谱保持稳定（图3B）。三臂CStar（7）在任何测试浓度下均未能实现单体发光型水相吸收谱。对比五臂与四臂CStars（5和6）在水中的光物理参数，5号材料凭借更高εmax与ΦF占据优势（图3D）。为直接对比水相短波红外相对亮度，在974 nm激发下测量了毛细管中浓度匹配的各CStars变体发射强度。与光物理测量结果一致，5号材料在1100 nm以上波段展现出短波红外发射强度（图3C）。综上可得出结论：五条聚合物臂在水溶性及亮度方面最为理想，遂将五臂色烯鎓星形聚合物（5）命名为CStar30，其中"30"代表每条POx聚合物臂所含MeOx重复单元数。

图4. CStar30和SulfoChrom7在水和蛋白质溶液中的比较（光物理性质见图3D）

接下来研究者评估了CStar30抵抗蛋白结合的能力。首先在纯水和富含白蛋白及其他生物分子的胎牛血清（FBS）中检测CStar30和SulfoChrom7（图4）。令人振奋的是，CStar30在纯水与FBS中均呈现单体吸收特征（图4A），且短波红外发射强度近乎一致（图4C）。更重要的是，CStar30在纯水中优异的光物理性质在FBS环境中依然保持稳定（图3D）。相反，SulfoChrom7从纯水到FBS环境中吸收光谱与短波红外发射强度发生剧烈变化：其在纯水中非辐射聚集占据主导，导致短波红外发射近乎消失，而FBS环境则恢复了其发光单体状态（图4B,4D）。既往研究表明ICG存在类似现象。

图5. 小鼠CStar30的单色成像

在确认CStar30具备优异体外性能后，研究者进一步开展小鼠活体短波红外成像实验（图5）。活体实验采用尾静脉注射CStar30（图5A），立即观察到肾脏富集现象（图5B），随时间推移膀胱信号持续增强。麻醉状态下静脉注射后血液循环时间估测为10-15分钟。值得注意的是，当小分子聚甲炔染料因蛋白结合作用主要富集于肝脏时，CStar30在肝脏仅呈现基础信号（图5E,5F），提示其具有体内隐形特性。注射3小时后整体信号显著减弱，1天后基本检测不到。处死动物后离体器官微弱荧光强度与探针主体已清除的结果一致。

图6. CStar30和ICG在小鼠体内的双色激发多路成像

为深入探究蛋白结合型与蛋白惰性荧光团在活体动力学的差异，采用ICG（蛋白结合型染料）与CStar30（蛋白惰性染料）进行激发多路复用双色成像（图6A）。选择ICG因其光谱与CStar30分离，可分别通过786 nm和974 nm交替激发，在单一短波红外发射窗口实现双通道检测（图6B）。该方法支持视频级成像速度的双荧光团同步观测。尽管ICG主要发射近红外光，其微弱发射尾迹仍可在短波红外波段显现（需更高注射浓度）。最终确定15:100 μM（CStar30）的浓度比可有效消除激发通道串扰（图6C），为活体双色成像奠定基础。

通过静脉或皮下共注射两种染料，研究者在同一动物体内直接比较荧光团的分布动力学与清除时程。静脉注射后，ICG在2分钟内流经血管并富集于肝脏（符合蛋白结合特性），而聚合物屏蔽的CStar30则同时抵达肾脏（图6D）。麻醉状态下持续监测30分钟发现：ICG肝脏信号持续增强（图6D蓝色），CStar30肾脏信号在10分钟开始下降，30分钟时膀胱积聚（图6D洋红色）。注射3小时后，ICG在肝脏、胃肠呈现强信号，而CStar30肾脏信号趋近于零，膀胱残留微弱。1天后CStar30信号消失，但ICG在注射2天后仍于网状内皮系统（如肝脏）清晰可见（图6D蓝色），此为蛋白结合型染料的典型滞留特征。皮下共注射实验显示：两种染料初期均富集于相同淋巴结（图6E紫色），但ICG同步转移至肝脏（图6E蓝色），而CStar30淋巴结滞留时间延长（注射后10分钟内肾脏/膀胱信号微弱）。其淋巴结强信号可持续1小时（图S29,S30），而ICG在注射2天后仍滞留于网状内皮组织（图6E蓝色），CStar30则无法检测。该结果证实蛋白结合会导致ICG干扰淋巴结定位及淋巴引流监测的时效性。

参考文献

Mobley E B, Lin E Y, Sletten E M. Chromenylium star polymers: Merging water solubility and stealth properties with shortwave infrared emissive fluorophores[J]. ACS Central Science, 2024.

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