黄曲霉的检验检疫要求与方法及检测方法的分析！

黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗（一般为双层），小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。

一、检验检疫要求

1995年，世界卫生组织制定的食品允许浓度为15ug/kg。

美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量（指b1+b2+g1+g2的总量）不能超过15ug/kg.人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ug/kg,其他动物饲料中的含量不能300ug/kg。

而欧盟国家规定更加严格，要求人类生活消费品中的b1的含量不能超过0.05ug/kg。

二、检验检疫方法

1、薄层层析

薄层层析（thin-layer chromatography,tlc)是在研究方面应用的分离技术.自1990年，它被列为aoac (association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析的功能。

2、液相色谱

液相色谱（liquid chromatography,lc)与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充.通常用tlc进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后，再用lc进行的定量测定。

3、免疫化学分析

利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的的免疫分析方法，也是的检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法（radioimmunoassay,ria),酶联免疫法（enzyme-linked of immunosorbent assay,elisa)和免疫层析法（immunoaflinity column assay,ica).它们均可以对进行定量测定。

(1)免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-hplc法

免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果，但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素（如b1)含量，而且易出现假阳性结果，难以控制.免疫亲和柱法（包括荧光光度法和hplc法）却能达到既定量准确又快速简便的要求。

免疫亲和柱的使用可以避免传统tlc和hplc的缺点，同时免疫亲和柱与tlc和hplc法结合可以大大提高工作效率，提高灵敏度和准确度。

免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计，紫外灯作为检测工具的快速分析方法.它克服了tlc和hplc法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒，异味的有机溶剂，毒害操作人员和污染环境的缺点.同时免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快，一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间；仪器设备轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，可以在小型实验或现场使用.可以进行总量 (b1b2g1g2) 的测定，检测限可达到1ug/kg,达到标准值以下测定范围为1-300ug/kg。

免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的hplc法更加安全，可靠，灵敏度和准确度高.它采用单克隆抗体免疫技术，可以性地将或其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。

分析原理试样中的用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤，稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量.也可以将甲醇-淋洗液的一部分注入hplc中，对b1,b2,g1,b2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的单克隆抗体固化在水不溶性的载体上，然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg。

(2)酶联免疫吸附法

1996年，nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便，敏感，特异，可作为多种抗原或抗体的测定，20世纪70年代后期，该方法引入真菌毒素的检测中，下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测b1。

原理：将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物.在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。

(3)微柱筛选法

可以用来半定量测定各种食品中b1,b2,g1,g2的总量。

原理：样品提取液中的被微柱管风硅镁型吸附层吸附后，在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光，则样品为阴性（方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离b1,b2,g1,g2,所以测得结果为总的含量。

(4)一步式检测金标试纸法

一步式检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式快速检测试纸可在5—10分钟完成对样品中的定性测定.借助标准样品，这种方法能估算的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。

三、检测方法分析

薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，由于其检测周期长，程序复杂，所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求.随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学，生物化学，分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速，简便，特异，敏感，低耗且适用的检测方法.而且以金标试纸为代表的这些方法已经被国家所广泛使用，引进和消化这些的方法是我们检测领域的当务之急.免疫亲和柱法优点很多，但由于检测费用过高，而无法普及.而一步式检测金标试纸法似乎更适用于中国，值得推广。

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