利用超高效液相色谱荧光检测器分析北大西洋环流海洋塑料 碎片中的多环芳烃

引言 由于海洋环境中积累的微塑料 碎片数量大且具有持久性，同 时人们暂时还不了解微塑料碎 片对海洋生态系统和食物链的影响，以上原因使海洋环境中积累的微塑料碎片引起了社会的广 泛关注。人们还担心，微塑料颗粒表面可能会吸引和聚集持久性有机污染物（POP），导致实 际浓度水平远高于周围水体。浓缩的持久性有机污染物会对海洋里的生物有机体造成危害，例 如：多环芳烃。多环芳烃会导致急性或慢性中毒。1-3 所以，与环境污染相关的 16 种多环芳 烃已经成为塑料碎片中研究最多的污染物。微塑料碎片中多环芳烃的检测可参考空气、水、固 体废弃物和食品中多环芳烃的检测标准和方法。这些方法通常用超高效液相色谱仪，紫外 或荧光检测器检测，检测时间超过 30 分钟。为获得更大的选择性，需要使用多环芳烃专用的 固定相以及更耐压的超高效液相色谱系统。超高效色谱系统的最大工作压力为 800 bar，因此 可以充分释放小颗粒的色谱柱（亚两微米）的高性能。本研究的目的是使用珀金埃尔默超高效 液相色谱系统结合超灵敏的荧光检测器探究分析 15 种多环芳烃的最佳分析时间以及定量限， 从而分析塑料碎片中极低浓度（ppb 浓度范围）的多环芳烃。在本应用文章中，根据 NF T  90-210 标准（第 5 版 /2009（5.2））建立了同时测定 15 种多环芳烃的超高效液相色谱快速梯度法。 4 使用安捷伦 Zorbax Eclipse PAH 1.8μm 色谱柱可以在 18 分钟内完成 15 种目标分析物的分离。 使用功能强大的珀金埃尔默超高效液相色谱系统荧光检测器进行检测，所有多环芳烃的定量限 均低于 5ppb，其中苊、菲、荧蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽的定量限低于 2.5ppb，芴、蒽、 苯并（a）蒽、苯并（a）芘和芘的定量限甚至可以做到 0.5 到 1ppb。

实验 硬件 / 软件 使用珀金埃尔默超高效液相色谱系统，包括溶剂输送模 块（四元泵）、进样模块和色谱柱模块（(PerkinElmer,  Shelton, CT, USA)。使用安捷伦 Zorbax Eclipse PAH 1.8 μm 150×2.1mm 色谱柱 (Agilent Technologies, Les Ulis,  France)）进行全部分析操作。利用珀金埃尔默超高效液 相色谱溶剂输送模块、紫外检测器和荧光检测器完成检 测 (PerkinElmer, Shelton, CT, USA)）。通过相关数据处理 软件进行仪器控制、分析和数据处理。 方法参数 液相色谱参数如下表所示。表 1 中说明了一般条件和流 动相梯度，乙腈为洗脱液 A，水为洗脱液 B；表 2 说明 了荧光检测器的程序。

荧光检测器的增益作为浓度范围的函数是固定的，并且 当浓度范围为 0.5-10ppb 时等于 100。建立了不同激发 波长和发射波长（分别为 λex 和 λem）的四通道法（A、 B、C 和 D），并在表 2 中说明。

溶剂、标准和样品 用于超高效液相色谱分析的水和乙腈是由 Fisher  Chemical SAS 提供的 Optima® 气质联用级。多环芳烃 储 备 标 准 混 合 物 由（Supelco （Sigma Aldrich®, Saint  Quentin Fallavier, France））提供。标准储备液为乙腈中 的萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、䓛、 苯并（j）荧蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、 二苯并（a,h）蒽、苯并（g,h,i）苝和茚并（1,2,3-cd）芘 浓度均为 10ppm。在 10mL 容量瓶中，用乙腈制备 1000ppb 多环芳烃标准溶液。进一步用乙腈将标准溶液 稀释到浓度为 0.5 到 10ppb 进行荧光检测，以确定 ppb 水 平 线 性。使 用 法 国 Expedition 7ème Continent 于 2015 年 5 月在北大西洋环流搜集到的塑料碎片。利用庚 烷和二氯甲烷二元混合物作为溶剂萃取多环芳烃，并进 行机械搅拌（24 小时两次）。在蒸发前，加入 50µL 二甲基甲酰胺（DMF），几分钟后再加入 200µL 乙腈。 所有样品在进样前均用直径为 4mm 的 0.2μm PTFE 过滤 器过滤 ,（Thermo Scientic®（Chromacol® 4-SF-02（T））

方法验证 该方法已根据水的理化分析准则法国 AFNOR NF  T90-210（2009）标准进行了方法验证。依据该分析准 则分析方法的定量限和线性是通过十次分析的标准偏差 来计算（最少五次）。在进行 NF T90-210 标准的“A 测试” 之前，应用格拉布斯统计测试来消除单变量数据集中的 异常值。线性验证是基于每天制备标准溶液，并进行五 次分析（每天一次，连续五天）。该测试基于通过充分性 统计测试（Fisher）将观察模型与实验误差进行比较。 与实验误差相比，如果模型误差可以忽略不计，则线性 是有效的。因此，为了验证线性，在同一条件下分析了 0.5-10μg/L 之间六个浓度水平（0.5、1、2.5、5、7 和 10μg/ L）的线性范围。NF T90-210 标准的“B 测试”具 有一定优势，能够以实验方式测试和验证预设的定量限， 这比基于标准偏差的方法更实际。进行初步测试以估算 定量限；然后通过分析假定定量限的两种标准进行验证， 连续五天重复三次。根据 NF T90-210 标准的修订，如 果不确定度低于 60%，定 量 限 被 验 证。然 后 用 NF  T90-210 标准的“D 测试”验证该方法的准确性。与前 文参考文献相比，该测试有助于对中间精度的评估和观 察到的偏差进行比较。参考文献对应于实验室确定的最 大可接受偏差（MAD）（MAD = 60%）。要求在中等精度 条件下，配备五次不同浓度的三种标准液进行分析，以 验证准确性。

结果和讨论 图 1 展示了 15 种浓度为 5ppb 的多环芳烃的峰形。16 种多环芳烃仅检测出了 15 种，因为苊烯不发荧光。图 1  是通过荧光信号来采集的色谱图。如表 3 所示，在 17 分钟内分离出15种多环芳烃，大部分可以定量至ppb级。

校准 图 2. 荧光检测器检测到的第一校准范围（1-10ppb）中芘、菲、萘的校准曲线（绘制了全部实验点）。 萘 荧蒽 菲 芘 表 4.16 种多环芳烃的保留时间、定量限和相关系数（R2 ）。 荧光通道 保留时间（min） 定量限（ppb） a × 10-7 b R2 萘 苊烯 * 苊 芴 菲 蒽 荧蒽 芘 苯并（a）蒽 䓛 苯并（b）荧蒽 苯并（k）荧蒽 苯并（a）芘 二苯并（a,h）蒽 苯并（g,h,i）苝 茚并（1,2,3-cd）芘 6,67 5 9.0145 1.1643×10-1 0.99881 7,43 10 3655.2 1.6127×10-1 0.99993 8,54 2.5 4.9146 9.2652×10-3 0.99890 8,74 1 1.5747 -6.5695×10-3 0.99996 9,37 2.5 3.0334 -5.3388×10-2 0.99994 10,00 1 1.1873 1.8462×10-2 0.99992 10,67 2.5 8.5764 -4.2598×10-2 0.99996 11,16 0.5 1.8317 -2.4191×10-2 0.99992 12,70 1 2.1172 -3.8712×10-2 0.99996 13,03 1 1.4742 -4.0780×10-2 0.99995 14,29 2.5 2.9070 4.3395×10-2 0.99996 14,83 2.5 0.5696 5.4586×10-2 0.99998 15,39 1 8.3745 -3.8785×10-2 0.99969 16,11 5 12.2717 -3.8785×10-2 0.99990 16,71 5 1.9880 6.6110×10-2 0.99982 17,01 5 7.5081 6.6123×10-2 0.99987 * 在波长 320nm 处有紫外吸收 根据 NF T 90-120 标准进行校准，根据相同的方法在同 一条件下评估检测和定量限（LOQ）。我们选择评估峰面 积，从而达到用荧光检测器（FLD）定量多环芳烃 μg/L 级 别的检出限。图 2 显示了荧光检测萘、菲、荧蒽、芘 的校准曲线，分别代表上述色谱图中的 1、3、4、6 峰。 根据 EN ISO 17993 标准测定的置信区间也显示为红色。 我们通过荧光检测（NFT 90-120 方法中指定的 Ex/Em 波长）验证了多环芳烃的线性。1-10ppb 浓度范围的校 准曲线在图 3 中呈现。利用 NFT 90-120 方法，考虑线 性拟合（y = ax + b，y 是面积，x 是多环芳烃浓度）以 及定量限（使用 15% 的最大可接受偏差），相关系数如 表 4 所示。线性拟合和回归系数（R2 ）由 NFT 90-120 方 法在定量限和 10ppb 之间自动确定。可以看到，对于所 有多环芳烃，获得的相关系数均高于 0.999。

结论 本研究旨在测量聚集在微塑料颗粒表面的多环芳烃含量， 以便了解海洋生物生态系统存在的风险。这项工作证明 了带有荧光和紫外检测器的珀金埃尔默超高效液相色谱 系统可快速、有效地分离 16 种多环芳烃。结果表明， 在测试浓度范围内（10-0.5ppb）每种多环芳烃具有较 好的线性关系。 通过分析的塑料碎片中检测的多环芳烃量，证明了荧光 检测器检测 ppb 水平多环芳烃的能力。 本研究证明带有荧光检测器的珀金埃尔默超高效液相色 谱仪灵敏度高、线性好，能够帮助了解微塑料颗粒作为 多环芳烃污染物载体的可能性。