永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳头间充质细胞操作使用指南

一、细胞概述

永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳头间充质细胞是一种经过特殊处理的细胞系，其来源于小鼠牙乳头组织。在正常生理状态下，牙乳头间充质细胞对于牙齿的发育和形成起着关键作用，它们能够分化为成牙本质细胞等，参与牙本质的合成与矿化。而该细胞系通过特定的基因操作，实现了在体外条件下的永生化培养，这为长期稳定的细胞实验研究提供了基础。

Floxed Fam20c 指的是在 Fam20c 基因周围引入了 Flox 序列，这一设计使得在特定的 Cre 酶作用下，可以实现对该基因的特异性敲除，从而方便研究 Fam20c 基因在细胞功能及相关生物学过程中的作用机制。

二、细胞培养前准备

（一）培养皿与培养基

在开始细胞培养前，需选择合适的培养皿。一般推荐使用经过认证的细胞培养专用皿，这些培养皿表面经过特殊处理，有利于细胞的贴壁和生长。对于永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳头间充质细胞，常用的培养基成分为基础培养基（如 Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）添加适量的胎牛血清（通常为 10% - 15%）、青霉素 - 链霉素溶液（以防止细菌和真菌污染，浓度一般为 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）以及一些必要的生长因子和营养添加剂，如 insulin-transferrin-selenium（ITS）等。不同实验室根据具体实验需求可能会对培养基成分进行微调，但上述基础成分是较为通用的组合。

（二）细胞复苏

从冻存状态复苏细胞是细胞培养的起始步骤。正确的复苏操作可以确保细胞的活性和正常生长。首先，准备好 37℃左右的水浴锅，将含有冻存细胞的冻存管从液氮罐中迅速取出，立即放入水浴锅中快速摇动，使细胞在短时间内（一般 1 - 2 分钟）融化。然后，用 75% 的酒精对冻存管外部进行消毒，避免外界细菌、真菌等污染细胞。在无菌操作台内，将冻存管内的细胞悬液快速加入到含有适量培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞分散均匀。接着进行离心（一般为 1000 - 1200rpm，5 分钟左右），弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，放入 37℃、5% CO₂的细胞培养箱中静置培养，让细胞逐渐恢复活性并开始贴壁生长。

三、细胞培养过程操作

（一）细胞观察与记录

定期观察细胞的生长状态是细胞培养过程中的重要环节。一般每天至少观察一次细胞，观察内容包括细胞的形态、颜色、是否有沉淀物或漂浮物等。正常生长的永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳头间充质细胞通常呈多边形或纺锤形，细胞边缘清晰，胞质均匀，颜色为淡黄色或透明。若细胞出现颜色变深、浑浊或有大量漂浮物，则可能提示细胞受到污染或生长状态不佳。同时，要记录细胞的生长情况，如细胞的密度变化、培养基的更换时间等，以便对细胞生长规律有清晰的了解，为后续实验安排提供依据。

（二）细胞传代

当细胞生长到一定密度（一般达到培养皿面积的 80% - 90% 左右）时，就需要进行传代操作，以防止细胞因密度过高而出现接触抑制，影响细胞的正常生长和功能。传代前，先用 PBS（磷酸盐缓冲液）轻轻冲洗培养皿，去除细胞表面的培养基和杂质。然后加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用浓度为 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA），在 37℃、5% CO₂的培养箱中孵育 1 - 2 分钟，观察细胞是否开始脱落。若细胞未全脱落，可轻轻敲击培养皿侧壁，促使细胞脱离培养皿表面。待细胞大部分脱落形成细胞悬液后，加入适量的含血清培养基终止胰蛋白酶的作用，将细胞悬液转移至离心管中，进行离心（条件同前），弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，按照适当的比例（如 1:2 或 1:3）将细胞分配到新的培养皿中，继续放入培养箱培养。

（三）细胞冻存

对于多余的细胞或需要长期保存的细胞系，冻存是常用的保存方法。冻存前，用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞悬液，离心后弃去上清液。加入适量的冻存液（一般冻存液的成分为 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）），轻轻吹打使细胞均匀分散在冻存液中。将细胞悬液分装至冻存管中，每管一般装 1 - 1.5ml。然后将冻存管放入程序降温盒中（如果没有程序降温盒，也可以采用缓慢手动降温的方法，如先在 4℃放置 30 分钟，再在 - 20℃放置 1 - 2 小时，最后转移到 - 80℃冰箱中），使细胞缓慢降温，最后将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

四、细胞实验应用操作

（一）基因转染实验

该细胞系常用于基因转染实验，以研究特定基因在细胞中的功能。在进行基因转染前，需确保细胞处于良好的生长状态，细胞密度一般在 70% - 80% 左右较为合适。对于质粒转染，常用脂质体介导的转染方法。首先，将质粒 DNA 与脂质体转染试剂按照一定比例（如 1:2 或 1:3）在无血清培养基中混合，室温孵育 15 - 30 分钟，使脂质体与质粒形成转染复合物。然后将转染复合物加入到细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿使复合物均匀分布。转染后 6 - 8 小时，可更换为含有血清的培养基，以维持细胞的正常生长。一般在转染后 24 - 72 小时，根据所转染基因的特点和实验需求，通过荧光显微镜观察转染效率（如果质粒携带荧光报告基因）或进行相关基因功能检测实验，如检测基因表达水平（采用实时荧光定量 PCR 或 Western blot 等方法）或细胞生物学功能变化（如细胞增殖、迁移、分化等实验）。

（二）细胞分化诱导实验

永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳头间充质细胞具有一定的分化潜能，可以用于细胞分化诱导实验研究。在诱导分化前，同样要保证细胞生长状态良好。将细胞以适当密度接种到培养皿中，待细胞贴壁后，更换为分化诱导培养基。分化诱导培养基的成分根据所期望的分化方向而有所不同，例如，若要诱导其向成牙本质细胞分化，通常需要在基础培养基中添加 β - 甘油磷酸钠、抗坏血酸等诱导因子。在诱导分化过程中，定期更换诱导培养基（一般每 2 - 3 天更换一次），同时观察细胞形态的变化以及检测分化相关标志物的表达情况。可以通过免疫荧光染色检测特定分化细胞的标志性蛋白表达，如检测成牙本质细胞分化的标志性蛋白 dentin sialophosphoprotein（DSPP）的表达情况，从而判断细胞分化的程度和效果。