ELISA实验常见问题分析与解决方案

　　ELISA实验常见问题分析与解决方案

　　一、显色异常问题

　　白板(无显色)‌

　　原因‌：试剂失活(如HRP污染或底物失效)、漏加关键组分(酶标抗体/显色剂)、孵育温度或时间不足‌。

　　解决‌：更换新鲜试剂，检查加样步骤，确保37℃孵育1-2小时并避光‌。

　　高背景/非特异性显色‌

　　原因‌：封闭不充分(如BSA浓度不足)、洗涤不净(残留未结合物质)、抗体浓度过高或交叉反应‌。

　　解决‌：优化封闭条件(延长至1-2小时)，增加洗涤次数(5次，每次1分钟)，调整抗体稀释比例‌。

　　二、重复性差

　　加样误差‌：复孔间加样量或时间不一致，导致CV%>20%‌。

　　洗板不均‌：洗板机管道阻塞或手工洗板力度不一致‌。

　　解决方案‌：使用同一移液器，规范加样速度;检查洗板机或手动充分拍干‌。

　　三、假阳性/假阴性

　　假阳性‌

　　溶血/细菌污染‌：红细胞释放过氧化物酶或细菌内源性HRP干扰‌。

　　类风湿因子(RF)‌：与IgG Fc段非特异性结合‌。

　　处理‌：离心去除溶血样本，添加RF阻断剂‌。

　　假阴性‌

　　抗原降解‌：反复冻融或保存时间过长‌。

　　竞争法操作错误‌：如先加酶标抗体后加样本‌。

　　处理‌：分装冻存样本，严格按说明书顺序加样‌。

　　四、标准曲线异常

　　标曲拟合差(R²<0.99)‌：标准品稀释错误或酶标仪波长设置不当‌。

　　批间差异‌：不同批次试剂活性波动，可用校正因子“S”校准历史数据‌。

　　五、关键操作注意事项

　　加样‌：枪头悬空加至孔底，避免触碰孔壁或溅洒‌。

　　孵育‌：覆盖封板膜防止蒸发，避免叠放导致温度不均‌。

　　洗涤‌：使用含0.05% Tween-20的洗涤液，拍干‌。

　　六、其他常见问题

　　边缘效应‌：周边孔显色偏强，建议质控孔置于板中央‌。

　　酶标板选择‌：聚苯乙烯板需评估吸附性能，避免批次差异‌。

　　(注：具体问题需结合试剂盒说明书及实验条件调整‌。)

　　注：以上资料仅供参考，不作为实验数据，具体请咨询品牌供应商或技术老师;

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