siRNA转染标准操作流程

以下是经过优化的 siRNA转染标准操作流程，整合了关键参数优化与避坑指南，适用于绝大多数哺乳动物细胞系（贴壁/悬浮），分为 实验设计、操作步骤、质控要点三部分：

一、实验设计关键点（转染前必看）

 Day 0：细胞铺板

1. 消化细胞 → 用wanquan培养基 调整密度 → 每孔接种 0.5mL（贴壁细胞数：5-8×10⁴；悬浮细胞数：2×10⁵）  

2. 37℃培养箱放置 16-24h（目标：转染时汇合度≈40%）  

关键细节：  

- siRNA工作液浓度 = 储存浓度×30（例：20μM储存液→工作液终浓度≈33nM）  

- 转染试剂用量参考说明书（RNAiMAX通常 试剂:siRNA体积比=1:1）  

 Day 2：换液与检测  

1. 转染后 6h 更换wanquan培养基（高毒性细胞如原代神经元需4h内换液）  

2. 继续培养 24-72h（基因沉默峰值时间需预实验确定）  

 三、质控关键步骤（决定成败！）

 1. 转染效率验证（必做）

- 方案1：转染 FAM标记siRNA → 24h后荧光显微镜观察（效率＞80%合格）  

- 方案2：共转染 EGFP质粒 → 计算绿色细胞占比（成本低但间接）  

 2. 沉默效果检测

 3. 细胞毒性评估

- MTT法：转染后24h检测，存活率应＞85%  

- 形态观察：悬浮细胞聚团、贴壁细胞空泡化→提示毒性过强  

 四、高频问题解决方案

五、特殊细胞优化方案

1. 原代细胞：  

   - 转染试剂：选 DharmaFECT™ Primary 或 jetPRIME®  

   - 方案：转染前饥饿处理2h（无血清培养基）→ 复合物孵育时间缩短至5min  

2. 悬浮细胞：  

   - 试剂：Neofect™ DNA/RNA Transfection Reagent  

   - 步骤：离心收集细胞 → 重悬于复合物 → 24孔板每孔接种500μL（密度5×10⁵/mL）  

3. 难转细胞（如神经元）：  

   - 专用试剂：NeuroFect™（佐剂提高穿透性）  

   - 转染后不换液 → 直接补等体积wanquan培养基  

六、试剂耗材推荐表

> 数据标准：合格实验需满足——转染效率＞80% + 沉默效率＞70% + 细胞存活＞85%

避雷总结：  

1. 勿用含抗生素或血清的培养基稀释复合物（灭活试剂）  

2. 转染后换液时间宁早勿晚（超8h毒性飙升）  

3. 冻存siRNA避免反复冻融＞3次（分装储存-80℃）  

按照此流程操作，可稳定获得可重复的基因沉默数据！

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