七大铁死亡检测技术+典型实验案例拆解_MedChemExpress(MCE 中国)

目前，铁死亡的标志物主要分为三类：细胞形态，分子水平和代谢水平。

脂质过氧化是铁死亡的核心驱动因素，过度的脂质过氧化通过产生有毒的磷脂氢过氧化物 (PLOOH)，在促进铁死亡中起着重要作用，因此过氧化脂质可用于细胞铁死亡的检测。

在对骨关节炎中软骨细胞铁死亡的研究中，为了证实 SM@ApoFn nanocage 具有抑制细胞铁死亡的功能，作者用脂溶性比率型荧光探针 BODIPY 581/591 C11 来评估细胞内脂质过氧化水平。如图所示，BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探针分析 IL-1β 预处理 12 小时后，各组给予 SM04690、ApoFn 和 SM@ApoFn 处理 24 h 的软骨细胞中细胞膜脂质的氧化和还原状态，其中 SM@ApoFn 减轻 IL-1β 引起的脂质过氧化。

图 1. SM@ApoFn 减轻 IL-1β 引起的脂质过氧化^[1]。 

BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探针分析 IL-1β 预处理 12 小时后，各组给予 SM04690/ApoFn 和 SM@ApoFn 处理 24 h 的软骨细胞中细胞膜脂质的氧化和还原状态。

活性氧 (ROS) 在铁死亡过程中不仅促进脂质过氧化和细胞损伤，还抑制抗氧化信号通路，是铁死亡 检 测 的 重 要 生 物 标 志 物。

在研究不同谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 抑制剂的纳米药物开发中，用 DCFH-DA 荧光探针检测不同纳米药物处理的 HT-1080 细胞中总的 ROS 水平。其中纳米药物 2b 对 GPX4 有较好的抑制效果，导致细胞内的 ROS 水平显著升高。

图 2. 不同纳米药物处理的 HT-1080 细胞中的总 ROS 水平检测^[2]。 

用 C11-BODIPY 和 DCFH-DA 荧光探针检测不同纳米药物处理的 HT-1080 细胞内脂质过氧化和总 ROS。

脂质过氧化反应过程中，大量的脂质过氧化初级产物在氧化反应中逐渐分解为一系列复杂的醛类化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。这些活性醛类物质能够攻击蛋白质等生物大分子，形成加合物，从而引发细胞的进一步损伤。

在研究真核翻译起始因子 EIF4E 通过控制脂质过氧化作为铁死亡敏感性的决定因素的研究中。科研人员为了研究 4HNE 产量增加是否会影响反馈回路，从而降低细胞对铁死亡的敏感性。结果表明，用 RSL3 处理后，ALDH1B1 的过表达限制了 WT 和 EIF4E 过表达的 Calu-1 细胞中 4HNE 的积累，这表明 ALDH1B1 在限制铁死亡期间细胞中 4HNE 的产生方面仍然发挥着重要作用。

需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除铁死亡外的多种氧化 应激状态下均可产生，在实际应用中，一般与其他检测方法进行相互验证，以提高结果的可靠性和准确性。

图 3. 用 RSL3（0.5 μM，4 小时）处理不同过表达体系的 Calu-1 细胞中 4HNE 染色的免疫荧光分析^[3]。

铁死亡过程中，细胞内亚铁离子的积累会导致氧化应激的增加，促进脂质过氧化。因此，细胞铁含量或者 Fe²⁺/Fe³⁺ 比值的测定可作为铁死亡监测的重要指标。FerroOrange 是一种特异性 Fe²⁺ 探针，与 Fe²⁺ 结合形成橙色荧光复合物，可通过荧光显微镜或流式细胞术检测 (Ex/Em: 542/572 nm), 从而定量分析细胞内 Fe²⁺ 的浓度。

研究人员在明确 PGS（一种天然产物 P-L）对肾脏、智力及神经保护的潜在作用，探索 PGS 的确切靶点及作用机制。在研究 PGS 是否减轻缺氧 BV2 细胞脂质过氧化物积累引起的铁死亡实验中，使用 FerroOrange 染色，PGS 可减轻 BV2 细胞中缺氧 (HH) 诱导的铁死亡。

图 4. PGS (一种天然产物 P-L, 50 μg/mL; P-M, 100 μg/mL; P-H, 200 μg/mL) 可减轻 BV2 细胞中缺氧 (HH) 诱导的铁死亡^[4]。

谷胱甘肽 (GSH) 是细胞内主要的抗氧化剂，在铁死亡过程中，GSH 水平显著下降，导致抗氧化能力减弱， 进而促进脂质过氧化物的积累。因此，检测 GSH 相关代谢等指标可用于监测铁死亡的过程。

铁死亡在肠缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用，抑制铁死亡可能为治疗该疾病提供新的途径，研究人员在对铁死亡发生的小鼠肠道缺血再灌注模型中进行检测，再灌注 30 min 后，组织中总铁和 Fe²⁺ 含量最高，LPO 产物 MDA 也随再灌注时间延长而积累，还原型 GSH 水平降低，氧化型 GSSG 水平升高。

图 5. 小鼠肠道缺血再灌注模型中，再灌注 30 min 后使用 GSH + GSSG/GSH 检测试剂盒评估肠道组织中谷胱甘肽、GSH、GSSG 和 GSH/GSSG 水平^[5]。

铁死亡细胞的典型形态学特征包括质膜完整性丧失，细胞膜破裂，线粒体，线粒体外膜破裂、嵴减少或缺失、膜密度增加，可通过透射电子显微镜 (TEM) 检测。此外，铁死亡发生时，也伴随着线粒体膜通透性增加和线粒体膜电位降低，内质网粘度增加和内质网应激， 以及溶酶体铁或一氧化氮 (NO) 的累积。可借助相关荧光探针，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

在研究溴结构域蛋白 4（BRD4）抑制 Erastin 诱导的铁死亡中，研究人员使测量了 BRD4 抑制前后细胞的氧化分解代谢，与 Erastin 处理组相比，当 BRD4 被其抑制剂 (+)-JQ1 和 PFI-1 抑制时，检测到的线粒体膜电位低得多。

图 6. Erastin (10 μM, 24 h) 诱导 HT1080 铁死亡，JC-1 检测线粒体膜电位变化^[6]。 

铁死亡主要由铁依赖性脂质过氧化引起，其调控机制包括多种，主要分为过氧化代谢部分 (如铁代谢和脂代谢途径) 和抗氧化部分 (如 System xc^--GSH-GPX4 途径，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ ESCRT-III 和 DHODH 途径)。铁死亡发生时，一些关键基因和蛋白表达水平发生变化，因此，采用 Western blot / 免疫荧光 / 免疫组织化学 / 实时荧光定量 PCR 技术等方法来表征铁死亡的发生。

在探讨铁死亡是否参与缺氧缺血性脑损伤及其机制的研究中，通过阻断左颈总动脉建立 7 日龄雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型。HIBD 组大鼠的活性氧水平显著升高，铁代谢相关蛋白转铁蛋白受体 (TFRC)、铁蛋白重链 (FHC)、铁蛋白轻链 (FLC) 的蛋白水平显著升高，而 SLC7A11、GSH、GPX4 的蛋白水平降低，这些变化导致细胞抗氧化能力下降、线粒体损伤，引起大脑皮层神经元铁死亡。

图 7. 通过阻断左颈总动脉建立 7 日龄雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型后 72 小时脑组织中铁死亡相关蛋白的水平^[7]。