通过环烯烃调节NIR-II荧光团的光谱性质实现成像

本文要点：本文报道了一系列基于芳烃的NIR-II荧光染料（称为cyazulenes），通过环烯烃调整光谱特性用于成像。通过将环烯烃与芳烃衍生物简易偶联来构建这些芳烃基荧光染料（CA965、CA985和CA1025），并展现出不同的H-聚集和J-聚集。特别值得注意的是，CA985能够在生物介质中形成显著的J-聚集体，具有强而尖锐的NIR-II发射，可用于小鼠体内血管和淋巴管的精细结构成像。此外，CA985显示出被动骨靶向能力，实现骨成像。本研究揭示了不同环烯烃对芳烃基荧光染料聚集体形成和光谱特性的影响，将推动基于芳烃的NIR-II荧光染料的发展。

图1. 芳烃基荧光染料（CA965、CA985和CA1025）的合成及其光谱性质

本文假设将两个芳烃单元与不同大小的环烯烃耦合，产物将因增强的π共轭聚甲基特性而发射NIR-II荧光，同时具备多样化的光谱特性。利用芳烃的5元环电负性，使其与醛缩合可生成大共轭体系。通过芳烃与环酮衍生的醛便捷缩合，合成了π共轭扩展的芳烃基染料（cyazulenes，图1A）。

不同环烯烃的cyazulenes展现出可调控的光物理特性。cyazulenes在有机溶剂中展现出NIR-II吸收（909–933 nm）和较强的荧光（945–1025 nm；Φ = 0.01–0.12%）。随着环烯烃碳原子数增加，这些cyazulenes在CHCl3中的吸收峰小幅蓝移，但发射峰显著红移；CA965、CA985和CA1025的吸收和发射峰半高宽分别为57和74 nm、79和131 nm、100和171 nm（图1B,C），表明随着环烯烃碳原子数增加，峰宽逐渐变宽。如图1D–F所示，cyazulenes产生规则的单吸收，CA965的荧光大幅减弱，并出现752 nm的蓝移吸收峰，这是典型H聚集的特征，同时CA965的荧光几乎不可见。在相同条件下，CA985和CA1025类似地产生蓝移吸收峰（表明H聚集形成），但同时在1162和1145 nm处观察到红移吸收峰，明显表明CA985和CA1025也可形成显著的J聚集。此外，CA985和CA1025在≈1170 nm处展现出典型红移且尖锐的荧光峰，进一步证实了J聚集的形成，体内成像应用极为有利。

图2. CA985聚集行为研究

尽管未能获得CA965和CA1025单晶，但成功制备了CA985单晶。单晶的俯视与侧视结构（图2B）显示，三个CA985分子以螺旋方式堆叠形成近中心对称的三角形，此堆积模式既不遵循J-聚集体的特征，也不符合H-聚集体的典型规律。通过对比CA985单晶及其粉末（通过CH₂Cl₂溶解单晶后挥发溶剂制备）的吸收与发射光谱，发现两者吸收光谱差异较小，但粉末在1180 nm处表现出比晶体更尖锐的荧光发射峰（1340 nm处伴随肩峰；图2C）。该粉末的1180 nm荧光特性与CA985在PBS中形成的J-聚集体相似，其尖锐发射特性有利于多色成像应用。

图3. CA985 NPs小鼠淋巴系统、血管和胫骨的NIR-II体内成像

为提高CA985的体内成像效能，采用DSPE-PEG2000作为载体材料制备纳米颗粒（NPs）。CA985在该NPs中仍可形成具有显著荧光的J-聚集体（J-aggregates），其粒径≈33 nm。通过足垫注射CA985-NPs进行小鼠淋巴结成像，结果显示腘淋巴结可清晰显影（信背比达28.5），且高倍图像中可观察到淋巴系统的四组淋巴瓣膜结构（图3A中白色箭头标记）。四组淋巴瓣膜的荧光强度分布显示平均半峰宽（FWHM）≈0.3 mm（图3B），为淋巴瓣膜尺寸研究提供了关键数据。通过静脉注射CA985-NPs进行小鼠血管成像，注射5分钟后全身血管（包括左右颈静脉）可清晰成像（平均FWHM≈0.6 mm，图3C-D）。随时间推移，CA985逐渐在肝脾富集，但50分钟后颈静脉仍可见信号。值得注意的是，股血管荧光强度下降而胫骨荧光增强（图3E-F），提示CA985可能具有骨成像潜力。

图4. CA985 NPs小鼠的离体和体内骨成像

进一步研究显示，CA985-NPs在小鼠骨骼系统中呈现特异性富集：注射12小时后，胫骨、胸骨及椎骨等部位荧光信号达到峰值。解剖实验表明，尾静脉注射CA985-NPs 12小时后，离体骨骼（尤其是富含骨髓的椎骨）仍保留显著荧光（图4A）；骨髓冲洗后骨组织荧光大幅减弱，而收集的骨髓显示强荧光信号（图4B）。对比实验证实，CA985的骨靶向特性与载体材料类型无关，而可能与其分子结构中薁环基团相关。活体及离体成像显示，CA985-NPs可实现小鼠胸骨、胫骨及足骨的高分辨成像（图4C），且两种模式下骨骼结构的FWHM具有良好一致性（图4D-I）。该特性使其成为研究骨骼疾病（如骨质疏松）的理想工具，为骨代谢异常等病理过程的在体监测提供了新策略。

图5. NIR-II多色荧光成像。通过CA965/CA985 NPs在950 nm BP滤光片下对小鼠腿部血管进行多色成像

相较于单色成像，多色活体成像可显著提升信息密度。利用950 nm带通（BP，925–975 nm）与1150 nm长通（LP）滤光片的光谱拆分特性，CA965-NPs与CA985-NPs可实现双色成像，成功应用于小鼠左右腿腘淋巴结的同步显影。为进一步提升成像可靠性，研究团队通过DSPE-PEG2000载体共载CA985与CA965制备CA965/CA985-NPs，利用比率荧光测量技术消除外部干扰因素影响。在小鼠腿部血管比率成像实验中，950 nm BP（红光通道）与1150 nm LP（绿光通道）虽均可显示血管轮廓，但难以区分动静脉（图5A）。通过比率成像处理（图5a5），背景噪声显著降低，血管半峰宽（FWHM）由≈0.26 mm优化至0.20 mm（图5B），实现动静脉的清晰分辨。此外，比率信号从左至右的梯度变化（图5a5）精确反映了血管距皮肤表面的深度递减趋势，该特征在单色成像中较难获取。

总结而言，本文提出了一种通过调节环烯烃来合成系列近红外二区（NIR-II）荧光团（CA965、CA985和CA1025）的策略，这些荧光团具有不同的聚集行为和特殊分析功能，适用于成像应用。研究表明，次甲基链中环烯烃碳原子数的可调节性使这些荧光团表现出不同的H-聚集和J-聚集行为；增加碳原子数会导致荧光团单体形式的吸收蓝移和荧光红移，这与经典花菁染料的行为不同。CA985，因其J-聚集体在PBS生物介质中具有强而尖锐的NIR-II发射。此外，本文证明了CA985可用于小鼠血管、淋巴收集管精细结构甚至骨骼的活体成像。所开发的cyazulenes类（尤其是具有被动骨靶向功能的CA985）的新化学特性将推动NIR-II荧光团的发展，促进多样化的成像应用。

参考文献

Gao W, Liu D, Li H, et al. NIR‐II Cyazulene Fluorophores with Adjustable Cycloalkenes and Spectroscopic Properties for Imaging Applications[J]. Advanced Healthcare Materials, 2025: 2404996.

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