异常威克汉姆酵母与酿酒酵母在混合发酵中的相互作用机制！

酵母菌是果酒酿造中主要的功能性微生物，根据其在酿造过程中功能不同而分为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非酿酒酵母。Sc具有较高的产酒能力与耐受性，在发酵过程中大多会占据优势并完成发酵；非酿酒酵母则能产生更加复杂的风味成分以及胞外酶等代谢物，可以将原料中的物质充分释放，将其转化为高级醇、酯等香气物质，提升果酒的品质。因此，将Sc和非酿酒酵母用于混合发酵果酒，能将原料中的风味更好地展示出来。

非酿酒酵母中有一类酵母菌在其生长过程中能产生较多的酯类香气成分及其前体，这类酵母菌可以叫做产酯酵母或产香酵母。产香酵母近年来被应用于很多食品的生产，如面食的发酵、酱油、食醋、白酒以及果酒的酿造中，使香气复杂化，具有提升产品品质的能力。但非酿酒酵母乙醇发酵能力较弱，常常不能将之用于纯种发酵。近年来很多研究将Sc和产香酵母混合发酵，但在混合发酵时，需要研究混合发酵过程中的相互作用关系和规律，才能更好地控制发酵各个阶段的菌种特性和代谢，优化生产发酵工艺。

本实验以前期筛选出的2 种优良酵母菌株为研究对象，对其进行单菌种及混合培养，通过考察混合发酵时生长变化规律，分析相互作用中细胞凋亡、代谢物以及细胞接触作用，一方面旨在对酵母菌相互作用机理及发酵动力学有更加深入的认识，另一方面在混合发酵工艺提升产品风味的基础上，更加准确调控微生物的生长和代谢，使得生产更加系统化。

一、材料与方法

1、材料与试剂

（1）菌种与培养基

Sc ZM-005为从自然发酵蓝莓酒中筛选出来的1 株产酒能力优良且能在WL鉴别培养基呈现颜色和形态的酵母菌；Wa K-008由贵州省发酵工程与生物制药重点实验室鉴定保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌20 min；YPD液体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌20 min；WL营养琼脂培养基：酵母粉5 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，硫酸锰0.125 g/L，硫酸镁0.002 5 g/L，氯化铁0.002 5 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；发酵培养基：无水葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min。

2、仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台、SPX-250B-Z型生化培养箱、YXQ-75S11立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZQPL-200立式全温震荡培养箱 天津市有限公司；HH-21-6电热恒温水浴锅 上海助蓝仪器科技有限公司；BSA124S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；JXFSTPRP-24细胞破碎仪 上海净信发展有限公司；NP-30S涡旋混合仪 常州恩培仪器制造商有限公司；LC-LX-H185C台式高速离心机 上海力辰邦西仪器科技有限公司；S-10生物传感器分析仪 深圳市西尔曼科技有限公司。

3、方法

（1）菌种活化

将－80 ℃甘油管保藏菌株，划线于YPD固体平板上，30 ℃恒温培养48 h后，将平板上单菌落挑取至100 mL灭菌的YPD液体培养基中，30 ℃、120 r/min培养48 h，使得培养基中细胞数达到108 CFU/mL，备于接种。

（2）共同接种发酵

对照组：将Sc和Wa分别接种于发酵培养基中，接种量为5×105 CFU/mL，30 ℃培养至发酵停止，发酵前2 d内每隔4 h取样，稀释涂布于WL鉴别培养基中，2 d后每隔24 h涂布一次，观察过程中生物量变化。

实验组：1）正常混合发酵：将Sc和Wa以1∶1（都为5×105 CFU/mL）比例接种于发酵培养基中，计数方法与对照组一致；2）不同初始浓度的Wa接种：梯度为5×105、2.5×106、1×107 CFU/mL接种于发酵培养基中，每隔2 d涂布于WL固体平板计数；3）高浓度Sc接种：Sc以107 CFU/mL接种量，Wa以5×105 CFU/mL同时接种于发酵培养基中，计数方法与对照组一致。

以上实验均在30 ℃下恒温培养。

（3）酵母细胞对乙醇耐受性

活化好的两种菌按接种量5×105 CFU/mL接种到100 mL YPD液体培养基（乙醇体积分数分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%接入培养基中）中，30 ℃、120 r/min培养48 h，稀释涂平板，30 ℃恒温培养2 d，计算菌落总数。以上实验组均有3 组平行，取平均值。

（4）发酵上清液制备

制备纯Sc发酵、纯Wa发酵以及混合发酵上清液，将培养2、4、6 d后的3 个时间段发酵液静置10 min，分别倒入50 mL已灭菌的离心管，8 000 r/min离心5 min，重复离心2 次，取上清液，再次倒入新的离心管，重复离心步骤，在超净台中过0.22 μm滤膜，去除剩余酵母细胞，得到无细胞的发酵上清液备用。

（5）死细胞和破碎细胞处理

参考Nissen等实验，100 ℃煮沸等量的Sc细胞10 min，得到死Sc细胞，放入100 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，重复离心2 次后备用；将5 000 r/min离心10 min后的细胞沉淀放入冷冻细胞破碎机中破碎5 min，再次重复离心，取出破碎细胞备用。

（6）透析袋实验

通过Renault等设计的一种新型模型，模仿其设计透析袋发酵罐实验，选择1 000 Da和12 kDa截留分子质量的透析袋，发酵罐内加入发酵培养基，将透析袋和发酵罐进行组合。透析袋100 ℃高温煮沸10 min备用，将煮好的透析袋放入发酵罐中，透析袋内外加入等量的发酵培养基，罐口封上封口膜，115 ℃灭菌20 min，发酵罐透气测温顶盖65 ℃下灭菌30 min取出，经过乙醇消毒后紫外线照射15 min，在超净台中组合，接菌后放入30 ℃恒温培养箱。

接种方式：将Wa接种于透析袋内，Sc接种于透析袋外，为验证透析袋实验准确性，作为对照将Sc接种在透析袋内，Wa接种在透析袋外，每4 h测定每组透析袋内外的生物量、葡萄糖、乙醇含量，测定至36 h。接种量均为5×105 CFU/mL。

以上实验均重复3 次取平均值。

（7）发酵动力学测定

3 组分别为纯Sc接种、纯Wa接种、Sc与Wa混合接种（1∶1）。其中发酵培养基为20%含糖量的液体YPD培养基，纯发酵以及混合发酵接种每种菌体接种量都为5×105 CFU/mL。接种后，每隔1 d称质量一次，一直到发酵结束为1 个周期，以CO2质量损失测定其发酵速率v，计算如下式所示：

式中：Mn为发酵第n天总质量损失；Mn－1为发酵第n－1天总质量损失。

（8）葡萄糖和乙醇测定

缓冲液准备：将缓冲液粉倒入缓冲液瓶，加入5 000 mL纯水充分溶解6 h后使用（必须一次性配完5 000 mL，不能拆分配制，否则会损坏酶膜）。

生物传感器测定：进行葡萄糖与乙醇标定，每次使用前，将葡萄糖（1 g/L）和乙醇（0.5 g/L）标准液从4 ℃取出，系统调至定标操作，将25 μL标准液注入感应器中，调整电极电量，定标3 次至系统显示通过，每测定10 次样品后需重新定标进样（乙醇量程0～1 g/L、葡萄糖量程0～2 g/L），样品条件：稀释倍数使得葡萄糖与乙醇都在量程范围内才能测定。

样品测定：将发酵培养基中的溶液混匀，在无菌超净台中取样，首先取1 mL样品放入离心管，2 000 r/min离心5 min，吸取离心清液中不同部分（上、中、下）溶液各100 μL，稀释于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容（稀释100 倍），再用标准溶液标定生物传感器，使得系统标定成功。测定时加入25 μL的样品稀释液，测定样品葡萄糖和乙醇含量，均测定3 次取平均值。

（9）生物量测定

平板计数法：在混合培养条件下，由于Sc和Wa在电子显微镜下生长形态相似，肉眼难以区分，有研究发现，WL选择培养基能分辨不同的酵母菌，通过预实验发现Sc在WL鉴别培养基中呈现黄色凸起状，而Wa在WL鉴别培养基中呈现白色扁平状，故可以采用WL鉴别培养基进行计数。

血球计数板法：添加亚甲基蓝溶液对酵母活细胞进行染色再计数。

4、数据处理

利用OrginPro 2018C软件对数据进行作图分析、利用Adobe illustrator CS6进行优化作图和组合。

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