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钙信号研究：常见钙离子检测工具及其应用_MedChemExpress(MCE 中国)
钙离子（Ca2+）作为生物体内重要的第二信使，在众多生理过程中发挥着至关重要的作用。从神经信号的传导到肌肉的收缩，从细胞的增殖与分化到激素的分泌，钙离子都扮演着重要的角色。
Section.01
细胞内钙离子检测方法
准确地检测和分析细胞内或组织中的钙离子浓度变化，对于深入理解各种生理和病理过程具有极其重要的意义[1]。细胞内钙离子的常见检测方法主要有钙离子选择性微电极测定法、同位素示踪法、核磁共振法、荧光探针法等。
钙离子选择性微电极测定法在检测过程中不需要使用指示剂，但在穿刺细胞时可能会造成损伤，进而引发渗漏问题。同位素示踪法虽然具有较高的灵敏度，却对静息状态下的 Ca2+ 水平不敏感，并且存在一定的放射性影响。核磁共振法虽能在接近生理状态下检测 Ca2+ 的变化，但其成本较高。相比之下，荧光探针法目前是检测细胞内钙离子分布及变化情况的广泛应用的方法。
Section.02
常见的钙离子探针
自上个世纪 Roger Tsien 团队开发出第一款钙离子荧光探针以来[2]，经过几十年的发展，市场上出现了众多种类的钙离子探针，目前已有许多商业化的钙离子探针。其中，常用的钙离子探针包括 Fluo-4 AM、Fluo-3 AM、Rhod-2 AM 和 Fura-2 AM 等。接下来，让我们逐一探讨这些钙离子探针的具体应用。
常用的 Ca2+ 荧光探针根据波长的不同，分为可见光激发 Ca2+ 荧光探针和紫外光激发 Ca2+ 荧光探针两大类。
与紫外光激发的荧光探针相比，可见光激发 Ca2+ 探针具有以下特点：
1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。
2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测 Ca2+ 变化，从而降低了对活细胞的光毒性。
3）Ca2+ 依赖性荧光强度增强，对 Ca2+ 变化水平检测敏感度更高。
4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。
5）兼容光激活探针以及 UV- 激发试剂，因此更方便于多参数检测。
6）无光谱偏移。
Fluo-3, AM
Fluo-3, AM (HY-D0716) 是一种常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3 游离配体几乎是非荧光性的，但与钙离子结合后荧光显著增强，荧光增加可达 60 至 80 倍。激发波长为 506 nm，发射波长为 526 nm。实际检测时推荐使用的激发波长为 488 nm 左右，发射波长为 525～530 nm。
MBP 处理降低了 Ca2+ 信号传导，此现象可以被 XBP1 敲低逆转。
图 1. 使用 Fluo-3AM 染料测量神经元 Ca2+ 信号[3]。
EtOH ：溶剂对照；MBP：邻苯二甲酸单丁酯。
Fluo-4, AM
Fluo-4 AM (HY-101896) 是 Fluo-3, AM 的升级版，荧光比 Fluo-3 更亮。Fluo-4, AM 分子上的两个氯原子被氟取代，这种结构上的微小变化其可以加载更快并且在相同条件下荧光更加明亮。它同样可以穿透细胞膜并在细胞内被酯酶剪切形成 Fluo-4。Fluo-4 的激发波长为 494 nm，发射波长为 516 nm。Fluo-4, AM 适用于荧光显微镜和荧光酶标仪等检测手段。
检测发现，US + MBs 处理使永生化人脑微血管内皮细胞 (HCMEC/D3) 细胞质中的 Ca2+ 水平上升，同时这种现象可以被抗坏血酸拮抗。
图 2. 通过 Fluo-4, AM 荧光探针检测细胞中的 Ca2+ 信号[4]。
US + MBs:超声和微泡处理；AA：抗坏血酸
Rhod-2 AM
Rhod-2 AM (HY-D0989), 罗丹明 123 (Rhodamine 123, Rh-123) 的行生产物，是一种高亲和力的可见光激发波长 Ca2+ 荧光探针，波长明显长于 Fluo-3 或 Fluo-4，其与 Ca2+ 结合后的大激发波长为 550 nm，发射波长为 578 nm，此探针更适用于具有高水平自荧光信号的细胞或组织 Ca2+ 水平检测，也可用来检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放。同时由于其正电荷特性，会特异性聚集在线粒体里，由此可以与 Rhodamine 123 联合使用用于测定线粒体内钙离子水平。
Rh-123 的绿色荧光表示线粒体正常，其强度随膜损伤而降低，而 Rhod-2 AM 的红色荧光表示线粒体 Ca2+ 水平，发现经 F/G/H-GNC 处理的细胞荧光从绿色变为红色，表明线粒体完整性受损，钙稳态被破坏。
Mag-Fluo-4 AM
Mag-Fluo-4 AM (HY-D1498) 是一种 Fluo-4 的类似物，具有特别的钙和镁离子检测特性。它对 Mg2+ 的结合亲和力（Kd）为 4.7 mM，而对 Ca2+ 的 Kd 为 22 µM，因此可以用作细胞内镁离子的指示剂以及低亲和力的钙离子指示剂。
Mag-Fluo-4 AM 染料能够特异性地被内质网捕获，因此非常适合检测内质网内游离钙离子浓度的变化。在荧光酶标仪下，Mag-Fluo-4 AM 的激发波长为 490 nm，发射波长为 525 nm。
Fura-2 AM 和 Indo-1 AM 均属于可见光激发的钙离子荧光指示剂，是目前常用的比率测量荧光探针。
1）与第一代染料 Quin-2 相比，Fura-2 和 Indo-1 具有更强的荧光发射，并且在生理 pH 范围内对 pH 变化不敏感。这一特性使得它们在多种实验条件下仍能保持稳定的读数。
2）Fura-2 和 Indo-1 对钙离子 (Ca2+) 具有更高的选择性，相比于二价金属离子如镁 (Mg2+)、锌 (Zn2+)、锰 (Mn2+)、铁 (Fe2+) 等，它们对 Ca2+ 的亲和力更强。
3）作为双波长荧光染料，Fura-2 和 Indo-1 在标定 Ca2+ 浓度时并不仅仅依赖于荧光强度的变化，而是通过比较不同波长下的荧光比率来实现。这一比率测量的方法大大提高了结果的准确性和可重复性。
Fura-2 AM
Fura-2 AM (HY-101897) 是紫外光激发的比值型或双波长荧光染料，其激发特性与 Ca2+ 浓度有关，当介质中没有 Ca2+ 时，其激发峰为 380 nm，当与钙结合时，激发峰向短波方向 340 nm 处移动，最后分别以 340 nm、380 nm 激发得到发射光的比例，这种比例与细胞内 Ca2+ 浓度成正比例的关系。发射光谱在 530 nm 处测量[6]。
比率型荧光探针减少了染料负载导致的指示不均匀、不良的染料保留和光漂白的影响。另外 Fura-2 还具有较强的抗荧光淬灭能力，在荧光显微镜或其它荧光检测设备上可以连续检测较长时间，也不会明显影响其荧光效果。
图 4. 发射光谱在 530 nm 处测量不同钙离子浓度时 Fura-2 的激发光谱的情况[6]。
Section.03
实验小贴士
以 Fluo-4 或 Fluo-4 AM 为例，常规的荧光探针如 Fluo-4 本身是一种极性较大的酸性化合物，无法直接进入细胞内。如果需要进行细胞内染色，通常需要借助膜片微电极 (patch pipette)、显微注射 (microinjection) 或胞引作用等方法来辅助药物的加载，这些过程往往繁琐且复杂。
为了解决这一问题，Fluo-4 的负性基团上结合了乙酰氧甲酯 (AM)。这一简单的化学改造不仅提高了其脂溶性，还消除了负电荷，从而显著增强了其细胞渗透性。研究者只需将细胞孵育在含有 Fluo-4 AM 的培养液中，就可以轻松实现探针的加载，省去了许多麻烦的步骤。
一旦 Fluo-4 AM 进入细胞后，细胞内的酯酶会对其进行水解，恢复为 Fluo-4 形式，使其能够在细胞内正常发挥生理功能。通过这种方法，荧光探针的应用变得更为简便与高效。
丙磺舒 (Probenecid) 是一种细胞膜中有机阴离子转运蛋白的抑制剂。当带有AM基团的钙离子荧光探针进入细胞后，会被细胞内的酯酶水解成带负电荷的形式，准备与钙离子结合。然而，一些细胞系中存在阴离子转运蛋白，这些蛋白会将已经转化为负电荷形式的钙离子荧光探针运输到细胞膜外。当加入丙磺舒后，它会抑制这些阴离子转运蛋白的功能，从而防止探针的外泄，使得探针能够在细胞内充分发挥作用达到好的效能。
根据文献报道，钙离子探针可以用于植物，在植物中比较常用的是 Fluo-4[7][8]。具体的方案方法可以参考文献。
此外，荧光染料在保存、实验的过程中需要注意避光操作。配制好的染色工作液必须一次使用完毕，不能冻存喔~
好啦！本期分享就到这里，有需要的小伙伴自行点赞收藏~
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氯化乙酰胆碱 (HY-B0282) 胆碱能 (cholinergic) 激动剂,可引起细胞外的 Ca2+ 内流 |
[1] Eisner D, et al. Physiology of intracellular calcium buffering [published correction appears in Physiol Rev. 2024 Jan 1;104(1):327.
[2] Kao JP, et al. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J Biol Chem. 1989 May 15;264(14):8179-84. PMID: 2498309.
[3] Cui F, et al. Maternal phthalates exposure promotes neural stem cell differentiation into phagocytic astrocytes and synapse engulfment via IRE1α/XBP1s pathway. Cell Rep. 2025;44(1):115126.
[4] Chen J, et al. Enhanced macromolecular substance extravasation through the blood-brain barrier via acoustic bubble-cell interactions. Ultrason Sonochem. 2024;103:106768.
[5] Han W, et al. Self-Sustained Biophotocatalytic Nano-Organelle Reactors with Programmable DNA Switches for Combating Tumor Metastasis. Adv Mater. Published online January 10, 2025.
[6] Pendin D, et al. A Synthetic Fluorescent Mitochondria-Targeted Sensor for Ratiometric Imaging of Calcium in Live Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(29):9917-9922.
[7] Wang Y, et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis root hairs. BMC Plant Biol. 2010;10:53.
[8] Wang Y, et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis root hairs. BMC Plant Biol. 2010 Mar 24;10:53.
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