子宫内膜着床失败是不育的重要原因，但目前对于其背后的机制尚不明确，主要是缺乏能够构建有组织的子宫内膜结构并在体外重现着床过程的技术。

尽管已经有了子宫内膜类器官，但它们仅由上皮细胞构成，且其顶端面向内部，阻碍了胚泡附着。此外，这些类器官被嵌入在细胞外基质（ECM）中，这可能阻碍胚泡与上皮细胞的直接接触。

(一)构建顶端向外的小鼠子宫内膜类器官的详细步骤

步骤

操作内容

培养条件

预期结果

1

小鼠子宫组织分离

- 使用胶原酶和DNase I在无Ca²⁺/Mg²⁺的PBS中消化30分钟，37°C水浴，100bpm摇晃

- 用冰冷PBS稀释至15ml，收集上皮细胞分数

获得子宫内膜上皮细胞（EECs）和基质细胞（ESCs）的分离物

2

细胞培养

- 将分离的细胞重新悬浮在基础培养基中，并离心两次

- 将上皮细胞分数与基质细胞分数混合，接种到12孔培养板中，每孔1ml扩增培养基（不涂任何涂层）

- 37°C，5%CO₂培养箱中培养，第1、3、5天更换培养基

细胞开始在培养板边缘向中心自然聚集，形成环状结构

3

聚集体的收集与再接种

- 第3天，用1000μl移液管收集环状聚集体到1.5ml管中，通过剪短的200μl移液管吹打分散成小聚集体

- 将小聚集体重新接种到同一培养皿中

EECs倾向于位于外围，ESCs占据内部

4

转移到低黏附培养皿

- 第7天，将每个聚集体分别挑出，并在96孔低黏附U型底培养皿中用扩张培养基培养

- 每两天更换一次培养基

经过3天悬浮培养（第10天），类器官形成

5

悬浮培养以促进类器官形成

悬浮培养过程中，覆盖外表面的透明层逐渐增厚，最终包裹整个聚集体

类器官外层由EECs组成，内层由ESCs填充，形成顶端向外的结构

6

激素处理以诱导接受状态

使用雌二醇（E2）、cAMP和醋酸甲地孕酮（MPA）处理类器官48小时

类器官对激素有响应，可模拟体内子宫内膜的接受状态

7

与胚泡共培养

将处理后的类器官与从GFP转基因小鼠获得的胚泡在低黏附U型底培养皿中共培养

观察胚泡附着、上皮内陷、吞噬作用和侵入等着床过程

（二）顶端向外的细胞排布是如何实现的？

2.1 利用细胞的自组织特性

- 细胞初始聚集：将子宫内膜上皮细胞（EECs）和基质细胞（ESCs）同时接种到黏附培养板中，在特定的培养基中培养。从第2天开始，细胞会自发聚集，到第3天形成大型环状结构。这种聚集现象是细胞自组织的初步表现，可能与细胞间的黏附特性有关。

- 细胞类型特异性重排：在第5天，细胞聚集体内部发生了显著的细胞类型特异性重排，EECs倾向于位于聚集体的外围，而ESCs则占据内部。这种重排是细胞依据自身特性进行的自我组织过程，可能涉及细胞间的相互识别和信号传递。

2.2 悬浮培养促进细胞极性形成

- 透明层的形成与细胞形态变化：将细胞聚集体转移到低黏附U型底培养皿中进行悬浮培养。在悬浮培养的前3天，覆盖聚集体外表面的透明层逐渐增厚并最终包裹整个聚集体。这个透明层是由E-钙黏蛋白阳性的EECs组成的上皮细胞层。同时，扁平的EECs逐渐变成柱状细胞，细胞高度增加，这表明细胞在悬浮培养过程中发生了形态变化，以适应三维环境并形成顶端向外的结构。

- 细胞表面结构的形成：扫描电子显微镜（SEM）观察显示，悬浮培养后类器官的整个表面都被光滑的EECs覆盖，没有ESCs暴露在外。此外，类器官表面观察到了微绒毛等顶端结构特征，还发现了类似pinopodes的大型圆顶状突起，这些结构在体内子宫内膜的腔面上皮细胞中也有表达，进一步证实了EECs的顶端向外取向。

2.3 培养基成分的引导作用

- 特定培养基的使用：在整个培养过程中，使用了专门为子宫内膜类器官培养设计的扩增培养基。这种培养基含有多种成分，如B27、N2、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、尼克酸胺、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子-基础（FGF-Basic）、Noggin、TGFβ/Alk抑制剂A83-01、R-spondin、WNT3A等，这些成分共同作用，为细胞的生长、分化和极性形成提供了必要的信号和营养支持，引导细胞形成顶端向外的结构。

2.4 培养步骤的协同作用

- 黏附培养与悬浮培养的结合：先在普通培养皿中进行黏附培养，使细胞能够初步聚集并形成一定的组织结构，然后通过分散和重新接种，再转移到低黏附培养皿中进行悬浮培养。这种培养方式的转变对于细胞的自组织和类器官的成熟至关重要，黏附培养为细胞提供了初始的相互作用和组织形成的平台，而悬浮培养则为细胞的进一步分化和极性形成提供了三维的空间环境，使EECs能够在外围形成顶端向外的结构，而ESCs则填充内部。

（三）本文的创新点

3.1 类器官结构设计的创新

- 顶端向外的细胞排布：传统子宫内膜类器官存在基底向外、顶端向内的极性，导致胚泡无法在体外附着到上皮细胞的顶端表面。而原文作者研究开发的类器官实现了顶端向外的结构，使E-钙黏蛋白阳性的上皮细胞位于外部，波形蛋白阳性的基质细胞位于内部，成功模拟了体内子宫内膜的细胞排布，为胚泡附着提供了合适的界面。

- 无需嵌入细胞外基质（ECM）：以往的类器官通常需要嵌入ECM如Matrigel中进行培养，这阻碍了胚泡与上皮细胞的直接接触。原文作者研究的类器官无需ECM嵌入，使上皮细胞暴露，有利于胚泡与上皮细胞的直接相互作用，更真实地模拟体内环境。

3.2 着床过程模拟的创新

- 完整着床过程的重现：在体外成功重现了小鼠胚泡着床的全过程，包括胚泡附着、上皮内陷、细胞吞噬（entosis）和胚泡侵入四个步骤。通过时间序列成像技术，实时观察到了这些动态过程，为研究着床机制提供了直观的证据。

- 着床反应的准确模拟：侵入类器官的胚泡衍生细胞表现出类似于滋养层巨细胞的形态和增殖蛋白阳性特征，同时周围的基质细胞表达了蜕膜化标记物环氧化酶2，这表明类器官能够准确模拟体内着床过程中的滋养层细胞分化和基质细胞蜕膜化反应。

3.3 类器官形成方法的创新

- 基于细胞自组织的形成机制：利用子宫内膜上皮细胞和基质细胞在黏附培养条件下的自发聚集能力，结合后续的悬浮培养，实现了类器官的自组织形成。这种形成机制不需要外力干预，依靠细胞自身的特性和相互作用，形成了具有特定空间结构的类器官。

- 的培养流程：先将细胞在普通培养皿中进行黏附培养，诱导细胞自发聚集形成环状结构，再经过分散和重新接种，最后转移至低黏附培养皿中进行悬浮培养，逐步形成类器官。这一的培养流程有助于细胞的自组织和类器官的成熟。

3.4 激素响应性的创新

类器官对激素处理有明显的响应，能够通过调节激素水平诱导类器官进入胚泡接受状态，显著提高了胚泡的附着和侵入效率。这种激素响应性对于研究着床过程中的内分泌调节机制具有重要意义，也为未来开发激素治疗策略提供了实验模型。

3.5 对比先前模型的创新

- 克服传统模型局限性：解决了传统二维和三维共培养模型在重建子宫内膜结构和模拟着床过程方面的不足，如无法准确模拟子宫内膜的复杂结构和细胞间相互作用等。

- 综合解决多个问题：虽然此前有研究分别解决了类器官的一些局限性，但本研究同时克服了所有关键问题，包括细胞极性、基质细胞的缺失以及ECM的阻碍等，使类器官在模拟体内环境和着床过程方面更加完善。

(四) 技 术 展 望

将顶端向外的小鼠子宫内膜类器官与Kirkstall Quasi Vivo类器官动态灌流培养系统相结合：

4.1 提升类器官的生理功能模拟

- 更真实的营养物质交换：Quasi Vivo系统通过动态灌流模拟体内血管系统，为类器官提供精准的营养物质输送和代谢废物清除。与传统的静态培养相比，这种动态环境能更真实地模拟体内子宫内膜的营养物质交换过程，使类器官的代谢和功能更接近体内真实状态。

- 增强细胞间和细胞-基质间相互作用：动态灌流产生的流体剪切力可以促进细胞间的信号传递和相互作用，模拟体内复杂的生物力学环境。同时，系统提供的三维培养支持结构有助于类器官维持更好的形态和细胞外基质的形成，从而增强细胞与基质之间的相互作用，进一步提升类器官的生理功能模拟。

4.2 改善类器官的长期培养与稳定性

- 延长类器官活性：在静态培养条件下，类器官在长时间培养过程中容易出现营养不良、代谢产物积累等问题，导致细胞活力下降和组织结构破坏。而Quasi Vivo系统的动态灌流能够持续提供新鲜的培养基，及时清除代谢废物，有助于维持类器官的长期活性和稳定性，延长其可使用时间。

- 促进类器官的成熟与分化：动态培养环境为类器官的成熟和分化提供了更理想的条件。细胞在持续的营养供应和适宜的生物力学刺激下，能够更好地完成其正常的生理功能和分化过程，使类器官的组织结构和功能更加完善，从而更准确地模拟体内子宫内膜的生理状态。

4.3 增强类器官与胚泡相互作用的准确性

- 更精准的激素调节：Quasi Vivo系统可以精确控制培养环境中的激素浓度和动态变化，模拟体内复杂的内分泌调节过程。在研究胚泡着床过程中，通过动态调节激素水平，可以更精确地研究不同激素对胚泡与类器官相互作用的影响，深入了解着床过程中的内分泌调节机制。

- 更真实的机械力环境：系统模拟的体内流体环境所产生的机械力，如剪切力等，可以影响细胞的黏附、迁移和分化等过程。在胚泡与类器官相互作用中，这些机械力可能对胚泡的附着和侵入等步骤产生重要影响。通过结合Quasi Vivo系统，可以更好地研究机械力在着床过程中的作用，为揭示其背后的分子机制提供新的视角。

4.4 推动疾病模型研究与药物筛选

- 更准确的疾病模型模拟：在研究子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌等）时，结合Quasi Vivo系统的顶端向外小鼠子宫内膜类器官可以更准确地模拟疾病发生发展的微环境。动态灌流培养能够反映疾病状态下复杂的生理病理变化，为研究疾病的发病机制提供更可靠的模型。

- 高通量药物筛选平台的构建：Quasi Vivo系统具有良好的扩展性和可重复性，通过将多个类器官培养模块连接在一起，可以构建高通量药物筛选平台。在这种平台上，可以同时测试多种药物对子宫内膜类器官的影响，快速筛选出具有潜在治疗效果的药物，为开发新的治疗策略提供有力支持。

公司主营产品：

Kilby 3D-clinostat 旋转细胞培养仪，

Kilby Gravite微/超重力三维细胞培养系统，

3D回转重力环境模拟系统，随机定位仪，

类器官芯片摇摆灌注仪，

Kirkstall 类器官串联芯片灌流仿生构建系统