支原体QPCR检测，三复孔重复性不好的原因？

复孔重复性不好，可能有以下几种原因：

首先，判断各个参数设置是否正确，例如是否扣除ROX（ABI系列机器）、基线和阈值线等；

其次，判断内参通道是否异常，判断PCR反应是否正常进行；

第三，CT值是否落在35之后，这是荧光定量PCR反应的灰区，在这个区间的CT值重复性非常差；

第四，试剂盒本身问题，酶、引物探针、反应条件等优化不完善；

第五，加样误差；

第六，仪器长时间未校准。

针对这几种原因，进行逐一排查

第一种情况，排查各类参数设置，看看是否能够解决问题；

第二种情况，如确实内参通道CT值异常，明显偏离说明书设定的范围，则样本中存在PCR抑制成分，需稀释10倍或抽提核酸进行检测；

第三种情况，需依据扩增曲线是否具备典型的S型来判断，如两次检测均具备典型的S型扩增曲线，则判为支原体阳性，样本发生了极其微弱的支原体污染；反之，则应为支原体阴性。

第四种情况，需要重新优化试剂盒。

第五种情况，建议移液器定期校准，使用时规范操作。

第六种情况，仪器要定期校准。