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浙江中医药大学附属杭州市中医院胡劲涛等教授在知网发布的《补充肾活跃血方对去势骨质疏松小鼠骨-血管形成偶联调节作用的实验研究》，探讨了补充肾活跃血方对去势骨质疏松小鼠骨量及骨代谢的影响。
实验中应用了布鲁克Micro-CT仪器，三维重建了小鼠的骨组织形态图像。
引言
绝经后骨质疏松是绝经女性的常见隐匿健康威胁，特征为骨量减、结构退变，骨折风险大增。约半数绝经女性患病，骨质疏松性骨折率18%～23%，严重影响生活质量。骨组织血管丰富，血管与骨形成紧密相关，绝经后骨组织血管减少。肾虚血瘀型多见，补充肾活跃血方(基于右归饮加桃仁、红花)疗效明显。
本研究用补充肾活跃血方医治去势骨质疏松小鼠，探讨其对骨-血管形成及骨代谢的影响。
实验前瞻
一、实验仪器：
实验仪器JB-P5包埋机；RM2016病理切片机；Bruker Skyscan1272三维X射线显微成像系统；E100光学显微镜。
Bruker Skyscan1272
二、实验准备：
实验动物选取50只4～5周龄SPF级健康雌性ICR小鼠,在室温(24±2)℃、湿度40%～60%、12 h昼夜交替照明的环境下饲养。
三、动物分组：
40只ICR小鼠适应性饲养1周，按随机数字表法分为假手术组(10只)和去势组(30只)。
四、造模：
去势小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注减少气道分泌物。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛发，予以聚维酮消毒3次后铺无菌巾。取腹部正中切口，逐层切开腹部肌肉及腹膜，沿输卵管寻找到卵巢，摘除卵巢，缝合伤口。假手术模型行只切除卵巢周围等量脂肪组织。
五、术后处理与分组：
去势组小鼠行卵巢去势手术后常规饲养8周，随机抽取3只小鼠证实骨质疏松造模成功后，随机取20 只成模小鼠按随机数字表法分为模型组和中药组，每组各10只。
六、给药:
假手术组及模型组：等量生理盐水灌胃。
中药组：补充肾活跃血方按小鼠给药剂量换算得小鼠含生药剂量为8.6 mg/kg，每日灌胃1次。
七、样本收集:
干预8周后处死，收集样本。
八、实验开展：
进行Micro-CT、TRAP染色、免疫荧光染色( EM-CN、CD31) 、骨代谢指标检测。
实验过程
一、Micro-CT检测骨组织形态
小鼠处死后，我们收集了股骨标本，并仔细剔除了骨组织周围的肌肉及肌腱组织。接着，我们使用了Bruker Skyscan1272三维X射线显微成像系统，按照设定的参数(电流140 μA、电压70 keV、扫描厚度12 μm)对股骨远端进行了扫描。随后，我们应用了Bruker CTAn Micro-CT Software对骨组织形态进行了分析，重点关注的指标包括：骨体积百分比(BV/TV)、小梁数量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。
二、TRAP染色观察破骨细胞数量
为了观察破骨细胞的数量，我们对骨组织进行了脱钙包埋处理，并制成了4 μm厚的石蜡切片。接着，我们进行了TRAP染色，并在显微镜下对破骨细胞的数量进行了观察。为了更精确地分析结果，我们采用了Image J软件进行了图像分析。
三、免疫荧光染色观察股骨远端干骺端CD31、EMCN阳性表达
我们首先对石蜡切片进行了脱蜡、抗原修复和封闭处理。然后，我们进行了一抗(CD31、EMCN)的4 ℃孵育过夜。第二天，我们进行了相应的二抗孵育，并随后采用了DAPI染液进行染色。在荧光显微镜下，我们进行了图片采集，并再次采用了Image J软件进行了图像分析。
四、骨代谢指标检测
为了检测骨代谢指标，我们收集了小鼠的腹主动脉血液，并通过200g离心力离心5分钟来收集血清。接着，我们应用了ELISA法检测了骨形成指标I型前胶原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)。
实验结果
一、各组小鼠骨组织形态的比较
Micro-CT三维重建图像显示假手术组骨小梁较多，模型组骨小梁明显减少，中药组较模型组骨小梁增加。见图1。定量分析结果显示，假手术组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型组和中药组，而中药组BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
图1 各组小鼠胫骨Micro-CT三维重建横断面
表1 各组小鼠Micro-CT检测结果比较
二、各组小鼠骨组织破骨细胞数量的比较
骨组织TRAP染色及定量分析显示，模型组TRAP阳性表达的数目高于假手术组和中药组，而假手术组TRAP阳性表达的数目少于中药组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2～图3。
图2 各组小鼠TRAP染色结果(×40)
图3 各组小鼠破骨细胞定量分析比较
四、各组小鼠股骨远端干骺端CD31、EMCN阳性表达血管比较
应用CD31、EMCN对股骨远端干骺端进行荧光双标以检测H血管的形成情况，结果显示模型组干骺端H血管的比例相比假手术组明显减少，中药组干骺端H血管的比例较模型组增加，但低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。提示补充肾活跃血方可以促进去势骨质疏松小鼠干骺端血管的形成。见图4。
图4 各组小鼠干骺端骨组织 CD31 + EMCN 阳性面积比较
五、各组小鼠血清骨代谢指标比较
表2 各组小鼠血清PINP、TRACP水平比较
结果
补充肾活跃血方可通过促进骨-血管形成,增加骨生成,减少骨吸收,提高去势骨质疏松小鼠的骨量。
绝经后骨质疏松症(PMOP)的主要症状为腰背疼痛、骨畸形和乏力，中医视其为“骨痿”“骨痹”，认为与肾虚血瘀有关。女子绝经后肾精亏虚，导致骨骼生长维系受影响，形成肾虚血瘀的恶性循环。补充肾活跃血是医治PMOP的重要原则，补充肾活跃血方通过补充肾健骨、活跃血祛瘀达到医治效果，研究显示它能增加去势骨质疏松小鼠的骨量和骨小梁数量及厚度。
近年来，研究发现H型血管与骨生长密切相关，H血管减少是PMOP的危险因素。骨质疏松女性血管内皮生长因子表达水平较低，与骨形成指标和骨密度正相关。促进H血管形成可以抑制破骨细胞功能，增加骨形成，预防和医治PMOP。
本文内容来源：
https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ifIT5_n5_GcV1J_62qIHt2mBULHLQLCH4IWu6b64IT-78Jz0V-qsV_jEX9rQg4MkMVNFmmiGcMSeGcofaLVoYoFta95NF_7dxzSaw4pKVV3dVneVV9Stp1xYCEFSyzqDMOJ88t1_3boQq7t4WlNQ0GlGIknHwpDg9FafXnFJjp8J1zw64PRwHODibLrhrDzgM_vj567UCeOt8rqmHfOypw==&uniplatform=NZKPT
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