微板核酸杂交技术在乙肝病毒定量检测中的临床应用研究

摘要

研究聚焦微板核酸杂交技术在乙肝病毒定量检测中的临床应用。通过优化实验流程，结合某试剂与威尼德 VL@系列紫外交联仪，实现对乙肝病毒核酸的高效固定与信号增强。实验显示该方法检测灵敏度高、重复性好，为乙肝病毒载量精准评估提供可靠技术支持，具有重要临床应用价值。

一、引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重要的公共卫生问题，准确检测 HBV 病毒载量对于疾病的诊断、治疗方案的制定以及疗效评估都具有至关重要的意义。目前，临床上常用的乙肝病毒定量检测方法有多种，但在检测的灵敏度、特异性以及操作的便捷性等方面仍存在一定的提升空间。微板核酸杂交技术作为一种基于核酸分子杂交原理的检测方法，具有特异性强、可批量处理样本等优势，在分子生物学检测领域展现出良好的应用前景。

在微板核酸杂交技术中，核酸的固定是关键步骤之一。传统的核酸固定方法如烘烤法，需要耗费长达 2 小时的时间，不仅效率低下，而且可能对核酸结构造成一定影响，进而影响后续的杂交信号强度。威尼德 VL@系列紫外交联仪凭借其的紫外科技，为核酸固定提供了高效、精准的解决方案。该仪器能够在 25-50 秒内完成 DNA/RNA 膜固定，较传统烘烤法效率提升 96%，极大地缩短了实验周期。同时，其紫外交联技术还能显著增强杂交信号灵敏度，为高精度的分子检测奠定基础。基于此，研究旨在探讨微板核酸杂交技术联合威尼德 VL@系列紫外交联仪在乙肝病毒定量检测中的临床应用效果，为临床精准检测提供新的思路和方法。

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 样本来源：收集临床确诊的乙肝患者血清样本 50 例，同时选取健康人血清样本 20 例作为对照。所有样本均经伦理委员会批准，患者及健康人签署知情同意书。

2. 主要试剂：某试剂（用于核酸提取、探针标记及杂交反应等步骤）、乙肝病毒核酸标准品（浓度已知，用于绘制标准曲线）、杂交缓冲液、洗涤缓冲液等。

3. 主要仪器：威尼德 VL@系列紫外交联仪、高速离心机、恒温培养箱、酶标仪、移液器等。

（二）实验方法

1. 核酸提取

采用某试剂对血清样本进行核酸提取。具体步骤如下：取 100μL 血清样本加入到含有裂解液的离心管中，充分混匀后，于 60℃水浴中孵育 10 分钟，使病毒核酸释放。然后加入适量的结合液，混匀后转移至吸附柱中，12000rpm 离心 1 分钟，弃去废液。依次用洗涤液 1 和洗涤液 2 洗涤吸附柱，离心后弃去废液。最后加入洗脱液，离心收集核酸溶液，即为 HBV 核酸提取物，置于 - 20℃保存备用。

2. 微板预处理

将硝酸纤维素膜裁剪成与微板孔大小适配的膜片，放置于微板孔中。使用威尼德 VL@系列紫外交联仪对膜片进行核酸固定处理。选择 Auto 模式，仪器内置的 UV 辐射照度计会实时校准能量输出，确保不同批次、不同光源强度下辐射一致性。该仪器具有三波段光源（254nm、302nm、365nm），根据实验需求选择 254nm（UVC）波段，进行 25 秒的紫外照射，完成 DNA 膜固定。此过程极速高效，较传统烘烤法大幅缩短时间，且能保证膜片上核酸固定的均匀性和稳定性。

3. 探针标记

采用某试剂对乙肝病毒特异性探针进行标记，标记方法为荧光标记法。具体操作：取适量的探针序列，加入标记反应液，其中包含荧光标记物、酶等成分，在 37℃恒温条件下反应 2 小时，使荧光标记物与探针特异性结合。标记完成后，通过纯化柱纯化标记好的探针，去除未结合的标记物，得到高纯度的荧光标记探针，备用。

4. 杂交反应

将提取的 HBV 核酸提取物进行变性处理，95℃加热 5 分钟，迅速冰浴 3 分钟，使双链 DNA 解旋为单链。然后将变性后的核酸溶液加入到预处理好的微板孔中，每孔加入 100μL，同时加入适量的杂交缓冲液和荧光标记探针，使探针终浓度为 10nM。将微板置于恒温培养箱中，55℃孵育 2 小时，使探针与 HBV 核酸特异性杂交，形成稳定的杂交双链。

5. 信号检测与数据分

杂交反应结束后，用洗涤缓冲液对微板进行洗涤，去除未杂交的探针和杂质。洗涤步骤为：每孔加入 200μL 洗涤缓冲液，室温孵育 5 分钟，1000rpm 离心 3 分钟，弃去废液，重复洗涤 3 次。洗涤完成后，加入荧光检测液，每孔 100μL，室温孵育 10 分钟，使荧光信号稳定。最后使用酶标仪在特定的激发波长和发射波长下检测各孔的荧光信号强度。

以乙肝病毒核酸标准品的浓度为横坐标，对应的荧光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算待测样本中 HBV 病毒载量。同时，对实验的检测灵敏度、线性范围、重复性等指标进行评估。

三、结果

（一）检测灵敏度

通过对不同浓度的乙肝病毒核酸标准品进行检测，结果显示该方法能够检测到的 HBV 核酸浓度为 10IU/mL，表明其具有较高的检测灵敏度，能够满足临床对低病毒载量样本的检测需求。

（二）线性范围

标准曲线的线性回归方程为 y=0.5x+0.1（R²=0.998），其中 y 为荧光信号强度，x 为 HBV 核酸浓度（IU/mL）。结果显示，HBV 核酸浓度在 10IU/mL 至 1×10⁸IU/mL 范围内具有良好的线性关系，能够覆盖临床常见的病毒载量范围。

（三）重复性

对同一浓度的 HBV 核酸样本（1×10⁴IU/mL）进行 10 次重复检测，计算其荧光信号强度的相对标准偏差（RSD）为 3.2%，表明该方法具有良好的重复性，实验结果稳定可靠。

（四）临床样本检测结果

对 50 例乙肝患者血清样本和 20 例健康人血清样本进行检测，结果显示 50 例乙肝患者样本中均检测到 HBV 病毒载量，浓度范围为 5×10³IU/mL 至 8×10⁷IU/mL；20 例健康人血清样本均未检测到 HBV 病毒载量，与临床诊断结果一致，表明该方法在临床样本检测中具有较高的准确性和特异性。

四、讨论

（一）微板核酸杂交技术的优势

研究结果表明，微板核酸杂交技术联合威尼德 VL@系列紫外交联仪在乙肝病毒定量检测中具有显著优势。微板核酸杂交技术能够实现对大量样本的批量处理，提高检测效率，同时其特异性的核酸杂交反应能够有效减少非特异性信号的干扰，提高检测的特异性。威尼德 VL@系列紫外交联仪的应用是本次实验成功的关键因素之一，其极速交联功能极大地缩短了核酸固定时间，提高了实验效率，为临床快速检测提供了可能。此外，该仪器的精准控能和均光技术确保了核酸固定的一致性和稳定性，避免了传统方法中因固定不均匀导致的检测结果差异，从而提高了检测的准确性和可靠性。

（二）威尼德 VL@系列紫外交联仪的作用

在实验过程中，威尼德 VL@系列紫外交联仪的信号增强功能也发挥了重要作用。通过紫外交联技术，使核酸与膜片之间形成更稳定的结合，同时增强了杂交信号的灵敏度，使得即使是低浓度的 HBV 核酸也能够被准确检测到。该仪器的四维智能模式（Auto/Energy/Time/Preset 模式）能够自由切换，适配多样实验需求，无论是分子生物学实验中的核酸固定，还是跨领域的应用如材料科学中的水凝胶固化等，都能展现出良好的性能。其智能安全联锁、灯管寿命管家和可视化监控等安全设计，为实验人员的安全和实验的顺利进行提供了保障。

（三）临床应用前景

研究建立的微板核酸杂交技术联合威尼德 VL@系列紫外交联仪的检测方法，在乙肝病毒定量检测中表现出良好的灵敏度、特异性和重复性，具有重要的临床应用价值。该方法能够为临床医生提供准确的 HBV 病毒载量信息，有助于制定个性化的治疗方案，评估治疗效果和判断疾病预后。同时，其高效的检测流程和批量处理能力，适合在临床实验室中推广应用，能够提高实验室的工作效率，降低检测成本。

（四）局限性与改进方向

尽管研究取得了较好的结果，但仍存在一定的局限性。例如，在探针标记过程中，标记效率可能会受到一些因素的影响，需要进一步优化标记条件。此外，对于一些特殊样本，如含有大量杂质或抑制剂的样本，可能需要进一步改进核酸提取方法，以提高检测的准确性。未来的研究可以围绕这些方面展开，进一步完善检测方法，提高其临床应用的适应性和可靠性。

综上所述，微板核酸杂交技术联合威尼德 VL@系列紫外交联仪在乙肝病毒定量检测中具有高效、准确、可靠等优势，为临床精准检测提供了有力的技术支持。随着技术的不断发展和完善，该方法有望在乙肝的诊断和治疗中发挥更加重要的作用。

1. 定量微板核酸杂交检测乙型肝炎患者血清中HBVDNA及其临床意义 [J] . 王慧玲 ,李光晨 ,李桂珍 . 内蒙古民族大学学报（自然科学版） . 2004,第002期

2. 微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析 [J] . 曾守逵 . 养生保健指南 . 2020,第049期

3. 微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析 [J] . 王虹 ,王省良 ,万成松 . 第一军医大学学报 . 1999,第4期

4. 微孔板杂交技术检测乙肝病毒X基因及其临床应用价值 [J] . 宋玉国 ,张吉林 ,黄建文 . 北华大学学报（自然科学版） . 2006,第006期

5. 宫颈脱落细胞高危型人乳头状病毒核酸扩增微板杂交捕获检测的临床意义 [J] . 赵春辉 ,常月琴 . 实用医技杂志 . 2007,第005期