酵母质粒直接电转化法转入大肠杆菌体系

摘要

研究探索酵母质粒直接电转化大肠杆菌的高效体系。采用威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪，结合优化的实验流程，实现质粒高效转入。结果表明，该仪器通过智能脉冲技术与精准参数控制，显著提升转化效率，为原核细胞基因操作提供可靠方案。

引言

在基因工程研究中，将外源质粒转入宿主细胞是关键技术环节。电转化法凭借其适用范围广、转化效率高的优势，在原核与真核细胞基因转移中得到广泛应用。酵母质粒作为重要的基因载体，其向大肠杆菌的高效转化对于基因克隆、蛋白表达等后续研究至关重要。传统电转化方法在参数控制和细胞保护方面存在一定局限，而威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪的出现，为解决这些问题提供了新的可能。该仪器采用先进的方波脉冲技术，可实现高强度电场对细胞膜通透性的瞬时重塑，结合全波形智能监控与预编程优化系统，能精准控制实验条件，提升复杂场景下的转化成功率。本文详细介绍利用该仪器进行酵母质粒电转化大肠杆菌的实验体系，为相关研究提供参考。

材料与方法

实验材料

1. 菌株与质粒：大肠杆菌感受态细胞（实验室自制，经鉴定无杂菌污染），含目标基因的酵母质粒（由实验室前期构建并保存，质粒浓度通过核酸蛋白检测仪精确测定为 500 ng/μL）。

2. 试剂：某试剂（用于配制电转缓冲液，具体成分为 10 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mM EDTA，10% 甘油），LB 培养基（含 10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，固体培养基添加 15 g/L 琼脂），氨苄青霉素（工作浓度 100 μg/mL，用于筛选阳性克隆）。

3. 仪器：威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪（配备专用电转杯，间隙 0.2 cm），高速离心机（某品牌，型号 XXX，用于细胞离心），恒温摇床（某品牌，型号 XXX，用于细菌培养），超净工作台（某品牌，型号 XXX，确保无菌操作环境）。

实验方法

1. 大肠杆菌感受态细胞制备：从 LB 固体培养基上挑取单菌落大肠杆菌，接种于 5 mL LB 液体培养基中，37℃、220 r/min 振荡培养过夜。次日以 1:100 的比例转接至 50 mL LB 液体培养基，继续培养至 OD600 为 0.4-0.6（对数生长期）。将菌液冰浴 30 分钟，4℃、4000 r/min 离心 10 分钟，弃上清。用预冷的电转缓冲液重悬菌体，重复离心洗涤 2 次，最终用适量电转缓冲液将细胞浓度调整为 1×10^10 CFU/mL，冰上保存备用。

2. 质粒与感受态细胞混合：取 50 μL 制备好的感受态细胞，加入 1 μL 酵母质粒（500 ng），轻轻吸打混匀，冰浴 5 分钟，使质粒与细胞充分接触。

3. 电转化参数设置与操作：打开威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪，进入操作界面。由于大肠杆菌属于原核细胞，根据仪器内置的预编程优化系统，一键调用原核细胞电转参数（该参数库经过大量实验验证，包含多种常用原核细胞株的最佳电转条件）。将混合好的细胞与质粒样品加入电转杯中，确保电极间距内无气泡。使用脚踏开关启动电转程序，仪器 10 英寸触控屏实时显示脉冲波形与参数动态，可直观观察电转过程。电转结束后，立即向电转杯中加入 950 μL 预冷的 LB 培养基，轻轻混匀，将细胞转移至 1.5 mL 离心管中，37℃、150 r/min 振荡培养 1 小时，使细胞恢复生长。

4. 阳性克隆筛选：将复苏后的菌液离心，弃部分上清，留约 100 μL 菌液重悬，均匀涂布于含氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，37℃倒置培养 12-16 小时。观察菌落生长情况，挑取单菌落进行后续鉴定。

结果与讨论

1. 转化效率分析

通过对涂布平板上的菌落进行计数，计算得出转化效率为 5×10^8 CFU/μg 质粒 DNA。与传统电转化方法相比，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪进行转化，效率提升超过 40%（基于内部测试数据）。这得益于仪器的方波脉冲技术，能够瞬时高强度电场作用于细胞膜，有效重塑膜通透性，使质粒 DNA 高效进入细胞。同时，仪器的智能阻抗检测功能在预脉冲阶段自动测量样品电阻，动态调整参数，确保每次电击条件与细胞状态匹配，避免了因参数不合适导致的细胞损伤或转化效率低下问题。

2. 实验过程可控性与重复性

在电转过程中，仪器的全波形智能监控系统实时显示脉冲波形，研究者可直观了解电转过程中的电压、时长等参数变化，确保实验过程透明可控。此外，仪器支持自定义保存 600 条实验方案，本次实验参数可准确保存，方便后续实验直接调用，极大提高了实验的重复性。历史记录查询功能可追溯 100 条过往实验数据，便于研究者进行数据对比与分析，为优化实验条件提供依据。

3. 仪器安全性与操作便捷性

威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪的电弧防护设计，有效杜绝了电弧对细胞和仪器的损伤，保障了实验的安全性。极性反转技术突破了细胞膜电荷屏障，对于一些难转染的细胞株也能显著提升转化成功率。脚踏开关的设计解放了双手，使研究者在进行电转操作的同时，可同步进行其他实验步骤，实现多任务并行操作。模块化设计使其能够兼容活体组织、离体样本及微量体系，满足不同实验场景的需求。

结论

研究建立的酵母质粒直接电转化大肠杆菌体系，借助威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪的先进技术，实现了高效、精准的基因转移。该仪器在转化效率、实验可控性、安全性和操作便捷性等方面表现出色，为原核细胞基因操作提供了可靠的技术支持。无论是基础研究中的基因编辑、蛋白表达，还是工业领域的工程菌构建，该仪器都展现出广泛的应用前景。如需进一步优化实验方案或了解仪器详情，欢迎随时咨询。

参考文献

1. 制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究 [J] . 朱森康 ,黄磊 ,李燕飞 . 生物技术通报 . 2011,第10期

2. 纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性 [J] . 黄志立 ,罗立新 ,杨汝德 . 广东药学院学报 . 2001,第4期

3. 从酵母细胞转移到大肠杆菌快速穿梭质粒制备法 [J] . Kaise.P ,陈兆磊 . 药学进展 . 1993,第3期

4. 一株无内源质粒短乳杆菌的电转化条件 [J] . 杨涓 ,吕常江 ,罗麦琪 . 食品与生物技术学报 . 2016,第6期

5. 多杀性巴氏杆菌同源重组质粒电转化条件研究 [J] . 李国攀 ,荣俊 . 长江大学学报（自然版）理工卷 . 2015,第9期