Western blot 实验注意事项

Western blot 实验注意事项

1. 配胶时，建议先加水， 再加Tris-HCL缓冲液，并且每加一种液体就混匀胶液。加入的TEMED有毒，务必在通风橱中操作， 并且加入后立即混匀、灌胶。丙烯酰胺未聚合的单体有神经毒性， 能够经皮肤吸收， 需戴手套操作。

2. AP作为催化剂能够提供氧自由基促使丙烯酰胺单体聚合， TEMED作为加速剂能够促进AP释放氧自由基，加速丙烯酰胺单体的聚合。空气温度较低时稍稍多加TEMED可加快胶的凝固速度，但要确保AP未变质，否则无效。

3. AP应现配现用， 否则变质会导致胶不聚合。另外， TEMED添加过量会使胶凝得过快并且孔径大小不一，影响蛋白的电泳，甚至可能烧胶。

4. 电泳内槽中应加入新鲜的电泳液， 并且应先拔梳子再安装入电泳槽， 添加电泳液。这样能够冲洗掉各孔中碎胶， 确保电泳时条带平直。

5. 建议两边加入预染的Protein Marker，方便观察不同KDa蛋白的分离情况，也方便后续的裁膜。

6. 电转液中一般需加入甲醇或乙醇， 而电转时的放热会加速醇类的挥发进而影响下一次重复使用时的电转效果。重复使用电转液时应考虑到醇类的挥发而适当延长电转时间， 最好是每次电转时都使用新的电转液。不同KDa的蛋白电转的条件不同， 所以可以针对目的蛋白进行切胶， 然后在不同条件下电转。

7. 盖上PVDF膜后， 不要再轻易移动， 否则条带会模糊。两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路，蛋白会转不过来。

8. 封闭常用脱脂奶粉或BSA，建议建议做磷酸化蛋白的western时使用BSA（牛血清蛋白） 作为封闭液。奶粉含有酪蛋白（一种磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出现背景深的现象。并且脱脂奶粉含磷酸酶， 磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化， 用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白时会受到影响。

9. 一抗在四度孵育时能够延缓抗体的衰减速度， 提高重复利用的次数。建议严格按照要求进行洗膜， 不要轻易减少洗膜的次数和时间。Tween20作为一种非离子表面活性剂， 能够减少非特异性的抗体结合， 降低背景。所以如果曝光后发现背景高，可以将1XPBST/TBST中Tween20从0.05%提高到0.5%，并且增加洗膜次数。

10. 曝光时尽量将目标蛋白和内参一起曝光， 便于比较。如果使用传统的压片曝光， 可以压两张甚至更多的片子并折角， 折角可以确定方向， 增加压片数量可以控制曝光强度。离膜最近的片子记录亮度低的蛋白条带的情况， 离膜远的蛋白可以保证亮度强的蛋白不过曝。

11. 曝光时多使用ECL发光试剂盒， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型试剂以增加亮度， 而内参等含量较多的蛋白则应使用普通的ECL发光试剂防止过亮，阻碍曝光。

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