2025 年 4 月 ，日本科学家佐藤俊朗教授团队在国际顶尖学术期刊 Nature 上发表研究论文。

Generation of human adult hepatocyte organoids with metaboli

该研究从直接取自人类患者的冷冻保存的成人肝细胞中培养出了具有代谢功能的成人肝细胞类器官。这些肝细胞类器官持续生长了三个月，并且在半年内仍保持分化能力。这些肝细胞类器官为肝脏移植/肝脏疾病治疗提供了新的发展平台。

步骤

操作细节

1. 肝细胞的获取与准备

从商业供应商处购买冻存的原代人肝细胞（PHHs），并使用 Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium 进行复苏。

2. 肝细胞的分选（可选）

使用流式细胞术对肝细胞进行分选，利用 APC 结合的小鼠抗人 EpCAM 抗体、PE 结合的小鼠抗 ASGPR 1 抗体和 DAPI 对肝细胞进行标记，分选出 ASGPR1+EpCAM−的肝细胞。

3. 类器官培养

将 1000 个 PHH 细胞嵌入 Matrigel 中，铺在 48 孔板中，每孔覆盖 300 μl 扩张培养基，置于 37℃、5% CO₂和 20% O₂的培养箱中培养。

4. 培养基的更换

每 2-3 天更换一次扩张培养基，直至类器官形成并开始扩增。

5. 类器官的传代

当类器官生长至一定大小后，使用 TrypLE Express 将其从 Matrigel 中解离，制成单细胞悬液，按 1:3 至 1:12 的比例进行传代。

6. 培养条件的优化

基于癌症基因组数据，筛选出 WNT、RAS、TGFβ、STAT3 和 PKA 通路的关键调节因子，设计包含 EGF、HGF 和 FGF-10（EHF）、Wnt/R-spondin、TGFβ 家族抑制剂（A83-01 和 Noggin）、IL-6 和 PKA 激活剂（forskolin）的扩张培养基，以促进类器官的长期扩增。

7. 类器官的纯化

由于原代人肝细胞样本中可能含有少量胆管细胞，需通过形态学观察手动去除胆管类器官，以促进肝细胞类器官的选择性生长。

8. OSM-STAT3 信号激活

在扩张培养基中添加 Oncostatin M（OSM），激活 STAT3 信号，以促进肝细胞类器官的扩增并维持其肝脏特性。

9. 类器官的分化培养（可选）

将扩增后的类器官（eHHOs）解离成单细胞，嵌入 Matrigel 中，预培养 7-14 天后，更换为分化培养基，再培养 10-14 天以获得分化后的类器官（dHHOs）。

10. 差异化培养（可选）

从分化后的类器官中，通过添加 Wnt/R-spondin 可诱导形成中央静脉标志物表达的类器官（dHHO + WR）。

11. 肝脏特异性功能诱导（可选）

将分化后的类器官置于不含葡萄糖的培养基中饥饿培养 18 小时，以诱导门脉静脉标志物和部分中央静脉标志物基因的表达。

12. 基因编辑（可选）

使用电穿孔技术将单向导 RNA（sgRNA）引入类器官中，结合 LATSi 和人类血小板裂解液，实现肝细胞类器官的基因编辑，构建基因敲除模型。

(一)哪些亮点是原文获得《Nature》录用的主要原因？

1. 研究的创新性和突破性

解决领域内关键难题：在细胞生物学领域，尤其是肝细胞研究方面，长期以来存在的一个关键难题是如何在体外平衡人肝细胞的扩增与功能维持。既往研究虽已取得一定进展，但始终难以实现肝细胞的长期自我更新并同时保持其功能活性。而该研究成功建立了具有代谢功能的人成肝细胞类器官新培养体系，实现了肝细胞的长期扩增和功能维持，为肝细胞生物学研究开辟了新的途径，这种创新性的突破是《Nature》极为重视的亮点之一，因为它不仅解决了现有技术瓶颈，还为后续相关研究奠定了新基础。

提出新方法和策略：该研究创新性地将癌症基因组学与肝细胞培养相结合，通过分析肝细胞癌的基因图谱，精准锁定关键的干细胞龛因素，如 Wnt/R-spondin、EGF 等，并以此为基础设计出的扩增培养基和分化培养基，开发出人成肝细胞类器官的优化培养条件。这种方法的提出为肝细胞培养领域带来了全新的视角和技术手段，也为其他类型细胞的培养提供了借鉴和思路，符合《Nature》对于研究方法创新性的要求。

2. 研究的重要性

对肝病研究的重大推动作用：所生成的人肝细胞类器官在建模肝病方面展现出巨大潜力，如代谢性肝病、肝衰竭等疾病模型的构建，为深入探究这些疾病的发病机制提供了有力工具。此外，它还为药物代谢和毒理学研究搭建了理想的平台，有助于加速新药研发进程，提高药物筛选的准确性和可靠性，从而对人类健康事业产生积极影响。《Nature》倾向于发表那些对科学领域具有广泛影响和推动作用的研究成果，而该研究在肝病研究和药物研发方面的潜在价值使其具备了这一特征。

对再生医学领域的意义：该研究有望为肝脏再生医学带来新的突破。通过优化人肝细胞类器官的培养体系，使其具备更好的功能和特性后，有望在未来的肝脏移植和组织修复等再生医学领域中发挥重要作用，为解决肝脏供体短缺等问题提供可能的解决方案，这进一步凸显了其研究的重要性。

3. 研究的交叉性和跨学科性

整合多学科知识和方法：该研究融合了细胞生物学、分子生物学、遗传学和医学等多学科领域的知识和方法，体现了跨学科研究的特点和优势。例如，通过基因编辑技术对肝细胞类器官进行基因敲除，创建疾病模型，这不仅需要细胞生物学方面的专业知识，还涉及到分子生物学中的基因操作技术和遗传学原理。同时，研究结果在医学领域的应用前景也体现了医学与基础科学研究的紧密结合。《Nature》作为综合性科学期刊，非常重视这种跨学科的研究，因为它能够打破学科界限，促进不同领域之间的交流与合作，推动科学的整体发展。

4. 研究的可读性和影响力

清晰的研究思路和表达：文章在阐述研究过程和结果时逻辑清晰、条理分明，使得读者能够容易地理解研究的重点和意义。这对于一篇高质量的科研论文来说至关重要，因为它能够确保研究成果能够准确、有效地传达给广大科研工作者和读者群体，从而促进科学知识的传播和交流。

潜在的广泛影响力：鉴于该研究在肝细胞培养技术和疾病模型构建方面的创新性和重要性，其研究成果有望在学术界和工业界引起广泛关注，并激发大量后续研究和应用。这不仅能够提升该研究领域的整体研究水平，还可能对相关产业（如制药业）产生积极的推动作用，符合《Nature》发表能够在科学界产生重要影响和作用的论文的宗旨。

（二）原文作者可能存在研究局限性

2.1 对OSM-STAT3激活的长期稳定性和安全性认识不足：虽发现OSM-STAT3激活能促进肝细胞增殖、抑制胆管化生并维持肝细胞特性，但其长期稳定性和安全性有待明确。长期激活STAT3可能使肝细胞面临转化或致癌风险。

2.2 肝细胞类器官在体外的功能测试不够完善：研究表明肝细胞类器官代谢功能与体内肝细胞相当，但体外功能测试可能存在局限性。例如，研究主要集中在肝细胞类器官在异体移植模型中的再群体效率及代谢区带结构重建，对于更复杂的体内环境和疾病模型中的功能表现，还需深入探究。

2.3 培养体系的规模化和标准化面临挑战：所描述培养体系在规模化和标准化方面可能存在问题。如原代肝细胞来源和质量、培养基成分和制备、培养过程操作技术等因素会影响肝细胞类器官生成的重复性和稳定性，建立标准化、可规模化培养体系对广泛应用至关重要。

2.4 对个体差异和疾病异质性考虑不足：研究可能未充分考虑个体差异和疾病异质性。不同个体肝细胞功能和对刺激反应存在差异，且肝细胞类器官培养体系和功能表征或难以涵盖肝病多样性，限制研究结果临床应用范围。

（三）结合Kirkstall Quasi Vivo类器官3D灌流动态构建系统，对新的科研方向及预期成果展望

3.1提升肝细胞类器官功能和成熟度：Kirkstall Quasi Vivo 3D灌流动态系统可为肝细胞类器官提供稳定可控培养环境。调控流速、氧浓度、营养供给等参数，能更精准模拟体内生理环境，促进肝细胞类器官分化和成熟，提升其代谢、药物代谢等功能，使其更接近体内肝细胞水平。

3.2 构建复杂肝脏疾病模型：利用Kirkstall Quasi Vivo类器官3D灌流动态构建系统将肝细胞类器官与其他肝细胞（如内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞等）结合，构建复杂肝脏疾病模型。可研究肝纤维化、肝硬化、肝癌等疾病中不同类型肝细胞相互作用及在疾病发生发展中的作用机制，深入理解疾病发病机制，挖掘新治疗靶点。

3.3 药物筛选和毒性测试应用：Kirkstall Quasi Vivo类器官3D灌流动态构建系统的动态培养环境有助于更准确评估药物对肝细胞类器官的影响。通过持续向培养系统中灌注药物并实时监测肝细胞类器官响应变化，可更可靠全面地获取药物代谢、毒性和疗效数据，提高药物筛选和毒性测试准确性和可靠性，减少动物实验依赖，加速新药研发进程。

3.4 个性化医疗研究：结合患者来源的肝细胞类器官与Kirkstall Quasi Vivo系统，可建立个性化肝脏疾病模型和药物反应预测平台。这有助于为患者制定个性化治疗方案，提高治疗效果和安全性。例如，利用代谢性肝病患者的肝细胞类器官筛选和优化药物，依据患者遗传背景和疾病特征实现精准治疗。

3.5 肝细胞类器官长期培养和存储：该系统有望延长肝细胞类器官培养时间并解决长期存储难题。优化培养条件和保存方法可长期保持肝细胞类器官活性和功能，为研究和临床应用提供稳定可靠肝细胞模型源。

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