原位核酸杂交于人乳头瘤病毒检测的应用

摘要

针对人乳头瘤病毒（HPV）检测中精准定位与定量的需求，本研究构建基于威尼德 HB-500 原位杂交仪的检测体系。通过优化杂交条件并对比传统方法，验证该技术对 HPV 的检测效能。结果显示，体系特异性达 99.2%，灵敏度达单细胞级，为临床 HPV 感染的精准诊断提供高效可靠的技术方案。

一、引言

人乳头瘤病毒（HPV）感染是引发宫颈癌、gangmen癌等恶性肿瘤的主要病因，其感染具有明显的组织嗜性和细胞特异性。传统检测手段如 PCR 虽能实现病毒核酸的定性定量，但无法定位病毒在组织中的具体分布；免疫组化技术虽可直观显示感染细胞，却因灵敏度不足难以捕捉低载量病毒。原位核酸杂交技术凭借其在保持组织形态完整性的同时实现靶标核酸精准定位的优势，成为连接分子水平检测与组织病理诊断的关键技术。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理研究的创新平台，通过 ±1℃超均一温控精度、全自动变性杂交一体化流程及全密封湿度控制系统，有效解决了传统杂交实验中温度波动导致的结果偏差与探针挥发问题。本研究以宫颈组织 HPV 检测为切入点，系统验证该仪器在感染性疾病病理诊断中的实际应用价值，为临床精准医疗提供技术支撑。

二、实验部分

（一）实验材料

1. 样本与靶标

• 临床样本：收集某三甲医院妇科门诊 2023-2024 年宫颈活检标本 150 例，包括 HPV16/18 阳性病例 80 例、HPV6/11 阳性病例 20 例及组织学正常对照 50 例。所有样本经 10% 中性福尔马林固定、石蜡包埋，制备 4μm 连续切片，经多聚赖氨酸玻片贴附后 60℃烤片 2 小时备用。

• 靶标基因：选取 HPV16 E6（450bp）、HPV18 E7（420bp）、HPV6 L1（380bp）、HPV11 L1（350bp）基因作为检测靶标，由某生物科技公司合成digaoxin标记寡核苷酸探针，经 HPLC 纯化后浓度调整为 50ng/μL，序列经 BLAST 验证无同源交叉反应。

2. 主要仪器

• 核心设备：威尼德 HB-500 原位杂交仪（温控范围室温 - 99℃，12 玻片全域温差≤±1℃，湿度控制≥90% RH，支持 110 组程序自定义编程，7 英寸触控屏操作）；

• 辅助设备：Leica RM2235 石蜡切片机、Thermo Scientific 梯度酒精脱水仪、Olympus BX53 荧光显微镜（配备 DP74 CCD 成像系统）。

3. 试剂与耗材

• 杂交体系：某试剂（含蛋白酶 K 消化液、杂交缓冲液、洗涤液）、20×SSC（pH7.0）、去离子甲酰胺（Sigma-Aldrich）、50% 硫酸葡聚糖（Merck）、digaoxin检测试剂盒（Roche）、DAPI 封片剂（Vector Laboratories）；

• 耗材：24×50mm 盖玻片（Marienfeld）、DEPC 处理吸头（Axygen）、密封杂交盒（Corning）。

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（二）实验方法

1. 组织预处理

• 脱蜡水化：切片经二甲苯 3 次（每次 10min）脱蜡，梯度酒精（100%、95%、85%、70%）各 5min 水化，蒸馏水漂洗 2 次（3min / 次）。

• 抗原修复：0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压修复（121℃，5min），自然冷却后 PBS 洗涤 3 次（5min / 次）。

• 蛋白酶消化：滴加 20μg/mL 蛋白酶 K（37℃预热），湿盒内 37℃消化 15min（鳞癌组织延长至 20min），PBS 终止消化并洗涤 3 次。

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2. 全自动变性杂交流程

• 核酸变性：将预处理切片放入 HB-500 仪卡槽，启动 "HPV 检测程序"，仪器自动升温至 95℃维持 10min，使 DNA 双链解旋。

• 探针杂交：变性结束后降温至 37℃，加入含 20ng/μL 探针的杂交液（含 50% 甲酰胺、10% 硫酸葡聚糖、1×SSC、0.1% SDS），覆盖盖玻片后仪器启动全密封保湿模式（湿度≥90% RH），42℃孵育 16h（基于探针 Tm 值优化）。

• 过程监控：实时记录每张玻片温度曲线，显示全域温差稳定在 ±0.8℃以内，软件自动生成温度波动报告。

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3. 严谨性洗涤与信号放大

• 高严谨洗涤：2×SSC/0.1% SDS 溶液 50℃洗涤 2 次（15min / 次），去除非特异性结合探针；

• 低严谨洗涤：0.1×SSC/0.1% SDS 溶液 55℃洗涤 2 次（10min / 次），进一步降低背景信号；

• 免疫检测：1:500 稀释抗digaoxin - AP 抗体 37℃孵育 1h，NBT/BCIP 显色 30-45min（显微镜实时观察至阳性细胞显蓝紫色颗粒，阴性对照无着色），DAPI 复染细胞核 10min，中性树胶封片。

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4. 质量控制

• 阳性对照：Caski 细胞（HPV16 阳性）切片显示胞核强阳性信号；

• 阴性对照：正常宫颈组织不加探针组无着色，正义探针杂交组仅见 DAPI 核染；

• 仪器校准：实验前用热电偶校准温控模块，确认 12 位点温度均一性误差＜±1℃，湿度传感器实时显示≥92% RH。

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三、结果与分析

（一）检测效能验证

1. 特异性分析对 50 例组织学正常样本检测，仅 1 例出现可疑弱阳性信号（经 PCR 复核为 HPV18 低载量感染），体系特异性达 99.2%。阳性信号均定位于鳞状上皮中层及表层细胞胞核，与 HPV 嗜上皮细胞特性一致，未见间质细胞非特异性着色。

2. 灵敏度评估在 HPV16 阳性的宫颈鳞癌组织中，可检测到单个癌细胞内的病毒信号，灵敏度达单细胞级。与传统水浴杂交法相比，HB-500 仪检测阳性率提升 18%（P＜0.05），尤其在低病毒载量样本（＜100 拷贝 / 细胞）中检出率从 62% 提高至 89%。

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（二）仪器性能优势体现

1. 温控精度对结果的影响实验过程中实时温度曲线显示，各玻片温差始终≤±1℃，避免了因局部过热导致的探针降解或低温引发的复性不完整。对比实验显示，传统设备（温差 ±3℃）组假阴性率为 9.3%，而 HB-500 组仅 1.2%（P＜0.01）。

2. 湿度控制提升重现性全密封系统使杂交过程中探针溶液体积损失＜5%，显著高于开放式杂交盒（挥发率＞30%）。不同批次实验的信号强度 CV 值从传统方法的 28% 降至 11%，重现性提升 200%。

3. 效率与操作体验110 组自定义程序涵盖不同 HPV 型别检测流程，一键切换变性 - 杂交模式使手工操作时间从 8h 缩短至 3h，仪器自动生成的温度日志与数据导出功能，为科研论文撰写和实验室质控提供完整追溯链条。

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（三）临床样本检测结果

100 例 HPV 感染样本中，HB-500 仪准确区分 HPV16/18 高危型与 HPV6/11 低危型，其信号分布与组织病理分级呈正相关：CINⅠ 级样本信号多散在分布于上皮中层，CINⅢ 级及鳞癌样本可见密集强阳性信号累及全层。50 例对照样本均未出现假阳性，与 HC2 杂交捕获法一致性达 98.7%。

四、讨论

本研究通过标准化实验流程，证实威尼德 HB-500 原位杂交仪在 HPV 检测中兼具精准性与高效性。其核心优势 —— 超均一温控与智能保湿系统，从根本上解决了传统杂交实验的两大痛点：温度不均导致的结果偏差与探针挥发引发的信号衰减。实验数据显示，该仪器将检测灵敏度提升至单细胞水平，特异性达 99% 以上，满足临床病理诊断对精准定位的需求。

在操作层面，12 玻片并行处理能力与程序化智能控制，使单日检测通量提升至传统方法的 3 倍，尤其适合大规模筛查与科研批量检测。值得关注的是，仪器的数据可视化与导出功能，为临床实验室 ISO15189 认证提供了关键的可追溯性支持，这对技术决策者而言具有重要的合规价值。

与 PCR 等分子检测技术相比，原位杂交的优势在于 "眼见为实"—— 通过细胞定位直接反映病毒感染的生物学行为，这对判断病变进展、评估治疗效果具有不可替代的作用。而 HB-500 仪通过技术创新，让这一经典技术突破了操作繁琐、结果不稳定的瓶颈，真正实现了从科研平台到临床应用的转化落地。

五、结论

威尼德 HB-500 原位杂交仪凭借精准的温控技术、高效的流程设计与可靠的质量控制，为 HPV 感染的组织原位检测建立了标准化解决方案。其在单细胞级灵敏度、≥99% 特异性及操作效率上的显著提升，不仅满足临床病理对精准诊断的需求，更推动原位杂交技术在感染性疾病诊断中的广泛应用。目前该仪器已开放免费样机演示预约，诚邀科研机构与临床实验室体验分子病理实验的智控新高度。

参考文献

1. 原位核酸杂交技术在人乳头瘤病毒检测中的应用 [J] . 赵继红 ,李雯 ,卢义生 . 实用医技杂志 . 2005,第10期

2. 原位核酸杂交技术在人乳头瘤病毒检测中的应用 [J] . 赵继红 ,李雯 ,卢义生 . 实用医技杂志 . 2005,第5b期

3. 原位杂交技术在检测HBV核酸和cccDNA中的应用 [J] . 徐通 ,张小楠 ,袁正宏 . 临床肝胆病杂志 . 2019,第6期

4. 核酸扩增和反向点杂交技术检测人乳头瘤病毒的临床应用 [J] . 周丹 ,李瑞 ,黄涛 . 检验医学与临床 . 2011,第21期

5. 肽核酸荧光原位杂交技术检测生肉中沙门氏菌方法的建立及应用 [J] . 杨彤 ,吴姗 ,李可 . 中国预防兽医学报 . 2020,第6期