核酸分子杂交技术检测乙肝病毒DNA价值

摘要

本文围绕核酸分子杂交技术检测乙肝病毒 DNA 的应用价值展开研究，借助威尼德 VH 系列分子杂交仪及配套模块，构建从核酸提取到杂交检测的完整体系。通过验证设备温控精度、交联效率等性能，结合临床样本检测，为该技术在乙肝病毒 DNA 检测中的应用提供实验依据。

一、引言

乙肝病毒（HBV）感染是全球重要的公共卫生问题，准确检测 HBV DNA 对于病情评估、疗效监测及预后判断至关重要。传统的乙肝病毒 DNA 检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA），在灵敏度和特异性上存在一定局限，难以满足精准医疗时代对乙肝病毒检测的更高要求。核酸分子杂交技术凭借其靶向识别特定 DNA 序列的能力，在病原检测领域展现出优势。威尼德 VH 系列分子杂交仪，以革新性的智能温控系统、多模态运动模式及高效的紫外交联技术，为构建精准、安全、高效的乙肝病毒 DNA 检测体系提供了有力支撑。本次研究旨在通过对该技术及相关设备的详细评估，明确其在 HBV DNA 检测中的实际应用价值，为临床诊断和科研工作提供可靠的技术参考。

二、实验部分

（一）实验材料

1. 1. 样本：收集临床疑似乙肝病毒感染患者的血清样本 200 份，同时选取 100 份健康人血清样本作为对照。所有样本均按照无菌操作规范采集，经编号后置于 - 80℃冰箱保存，避免反复冻融，以确保样本中 DNA 的完整性和活性。

3. 2. 主要仪器：威尼德 VH 系列分子杂交仪，包括 VH-1000 和 VH-4000 ，以及配套的紫外交联模块。VH-1000 具备旋转运动模式（10-30rpm 无极调速），适用于核酸杂交和基础孵育等场景，可容纳 4x300ml 杂交瓶；VH-4000 支持旋转、圆周、翘板三模式，能满足分子诊断全流程需求，包括杂交、洗脱、定量 PCR 及微生物培养等，可适配 8x500ml 杂交瓶或 24 块标准酶标板。两款仪器均搭载微芯片智能温控系统，温控精度达 ±0.5℃，结合碳纤维热导技术（热能转换率 95%）和 360° 动态热风循环，确保腔体温度均匀性误差 <±0.5℃，5 分钟内即可实现快速均温。紫外交联模块内置 UV 辐射照度计，能实时补偿灯管老化，能量输出一致性达国家标准（CV<3%），具备 Auto Mode、Energy Mode 等四大智能模式，可一键适配 DNA/RNA 膜交联。

5. 3. 试剂：某试剂，包括乙肝病毒特异性探针、核酸提取试剂、杂交缓冲液、洗涤液（含 2×SSC，0.1% SDS 的高盐洗涤液和含 0.1×SSC，0.1% SDS 的低盐洗涤液）等，所有试剂均按照说明书要求在合适温度下保存，使用前恢复至室温并充分混匀。

（二）实验方法

1. 1. 样本预处理与核酸提取：将血清样本从 - 80℃冰箱取出，室温解冻后轻轻颠倒混匀。取 200μL 血清加入含有磁珠和裂解液的离心管中，涡旋振荡 1 分钟，使细胞充分裂解。将离心管放入恒温金属浴中，65℃孵育 10 分钟，促进核酸释放。然后将样本转移至威尼德 VH-4000 分子杂交仪中，选择翘板运动模式，转速设置为 30rpm，处理时间 15 分钟，进一步使磁珠与核酸充分结合。按照某试剂的核酸提取操作步骤，依次进行洗涤、洗脱等步骤，最终得到 HBV DNA 样本。将提取的核酸样本经紫外分光光度计测定浓度和纯度（OD260/OD280 在 1.8-2.0 之间视为合格），合格样本置于 - 20℃冰箱保存备用。

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3. 2. 紫外交联固定：将制备好的 HBV DNA 样本均匀点样于尼龙膜上，室温下自然干燥 30 分钟。将干燥后的尼龙膜放入威尼德紫外交联模块中，选择 Auto Mode 模式，该模式可根据核酸类型和膜的特性自动设定最佳的紫外能量和照射时间。实验过程中，内置的 UV 辐射照度计实时监测紫外能量输出，确保能量输出一致性。25 秒后，交联完成，取出尼龙膜，用无菌 PBS 缓冲液轻轻冲洗表面，去除未结合的杂质，晾干备用。

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5. 3. 分子杂交反应：将处理好的尼龙膜放入杂交袋中，加入适量预热至 65℃的杂交缓冲液（每平方厘米尼龙膜加入 10μL 缓冲液）和乙肝病毒特异性探针（探针浓度为 15ng/μL），排除袋内空气后密封。将杂交袋放入威尼德 VH-4000 分子杂交仪中，选择圆周运动模式，转速设定为 50rpm，杂交温度设置为 65℃，杂交时间 16 小时。仪器的智能温控系统通过碳纤维电热管和三维热风循环技术，持续监测并维持腔体温度稳定，确保杂交反应在精确的温度条件下进行。在杂交过程中，定期观察仪器运行状态，记录温度和转速等参数，确保无异常情况发生。

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7. 4. 洗涤与信号检测：杂交结束后，取出杂交袋，剪开并小心取出尼龙膜，放入装有高盐洗涤液的培养皿中，37℃条件下在威尼德 VH-1000 分子杂交仪中进行旋转洗涤（转速 20rpm），洗涤两次，每次 20 分钟，以去除非特异性结合的探针。然后更换为低盐洗涤液，55℃下继续旋转洗涤两次，每次 15 分钟，进一步提高洗涤特异性。洗涤完成后，将尼龙膜用无菌滤纸吸干表面水分，置于避光处晾干。采用化学发光法进行信号检测，在尼龙膜上均匀滴加发光试剂，室温孵育 10 分钟，使发光试剂与杂交成功的探针结合。将尼龙膜放入化学发光成像系统中，进行曝光成像，曝光时间根据信号强度调整（通常为 1-5 分钟）。

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9. 5. 结果判定：以阳性对照样本（已知含有 HBV DNA 的标准品）和阴性对照样本（健康人血清提取的核酸）作为参考。阳性对照样本应显示清晰的发光信号，阴性对照样本应无明显信号。对于实验样本，若发光信号强度高于阴性对照样本 3 倍以上，则判定为阳性，表明样本中含有 HBV DNA；若信号强度与阴性对照样本相近或无信号，则判定为阴性。同时，通过图像分析软件对发光信号进行定量分析，计算信号强度与 HBV DNA 浓度的相关性。

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（三）实验质量控制

实验过程中严格进行质量控制，每批实验均设置 3 个阳性对照和 3 个阴性对照，确保对照样本结果符合预期，否则该批实验数据无效。定期对威尼德分子杂交仪和紫外交联模块进行校准，校准内容包括温控精度、运动模式稳定性、紫外能量输出等指标。每次实验前检查仪器的运行状态，确保设备处于最佳工作条件。在核酸提取环节，随机抽取 10% 的样本进行重复提取，计算提取效率的变异系数（CV），确保 CV<5%。对探针的浓度和纯度进行严格检测，避免因探针质量问题影响实验结果。实验数据采用双人双机录入和核对，确保数据的准确性和完整性。

三、结果与分析

（一）设备性能指标

1. 1. 温控精度与均匀性：通过在 VH-4000 分子杂交仪腔体内放置多个温度传感器，实时监测不同位置的温度变化。结果显示，在 65℃杂交温度下，各监测点温度波动均控制在 ±0.5℃以内，腔体温度均匀性误差 <±0.5℃，满足核酸杂交反应对温度精度的苛刻要求。与传统水浴摇床相比，该设备解决了水浴污染风险，且温度稳定性显著提高，为杂交反应提供了更可靠的环境。

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3. 2. 交联效率与速度：紫外交联模块在 Auto Mode 模式下，仅需 25 秒即可完成核酸固定，较传统烘烤法（需 2-3 小时）效率提升近 90%。通过对交联后尼龙膜上 DNA 的荧光定量分析，结果表明，该模块的交联效率较传统方法提升 180%，且不同批次实验的能量输出一致性良好（CV<3%），确保了核酸与膜的高效结合，为后续杂交反应奠定了坚实基础。

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5. 3. 多模态适配与实验通量：VH 系列分子杂交仪的多模态运动模式在实验中表现出色。圆周运动模式在杂交反应中使探针与核酸充分接触，显著提高了杂交效率；翘板运动模式在样本预处理和洗涤过程中，有效促进了磁珠与核酸的结合及杂质的去除，提升了核酸提取质量和洗涤效果。VH-4000 可同时处理 24 块标准酶标板或 8x500ml 杂交瓶，极大提高了实验通量，满足大规模样本检测的需求。

（二）检测结果

1. 1. 临床样本检测：对 200 份疑似乙肝病毒感染患者的血清样本进行检测，结果显示阳性样本 85 份，阴性样本 115 份。与临床金标准（荧光定量 PCR 法）进行对比，该检测技术的灵敏度为 94.4%（85/90），特异性为 96.7%（102/105）。在对阳性样本的信号强度与 HBV DNA 浓度进行相关性分析时发现，两者呈显著正相关（r=0.92，P<0.01），表明该技术不仅能定性检测 HBV DNA，还可在一定程度上反映病毒载量。

2. 2. 对照样本检测：100 份健康人血清样本检测结果均为阴性，无假阳性现象出现，进一步验证了该检测方法的高特异性。在重复性实验中，对同一阳性样本进行 5 次独立检测，结果均为阳性，信号强度变异系数为 3.2%，显示出良好的重复性和稳定性。

（三）结果讨论

本次实验结果表明，基于威尼德 VH 系列分子杂交仪及紫外交联模块构建的核酸分子杂交检测体系，在 HBV DNA 检测中具有显著优势。设备的三重控温黑科技（微芯片智能温控系统、碳纤维热导技术、360° 动态热风循环）确保了精确的温度控制和均匀性，为杂交反应提供了最佳条件，有效避免了因温度波动导致的假阴性或假阳性结果。多模态运动模式和灵活的实验通量设计，满足了不同实验环节和样本规模的需求，提高了实验效率和操作便利性。紫外交联模块的高效交联技术，大大缩短了实验时间，同时保证了核酸固定的质量，是整个检测流程高效运行的关键环节。

然而，实验过程中也发现，对于 HBV DNA 载量极低的样本（<10³ 拷贝 /ml），检测灵敏度略有下降。这可能与探针的标记效率、杂交时间或洗涤条件有关。未来可通过优化探针标记方法、延长杂交时间或调整洗涤液浓度等方式，进一步提高对低载量样本的检测能力。此外，虽然该设备在温控和运动模式上表现优异，但在处理极微量样本时，仍需注意操作的精细度，避免样本损失。

四、结论

威尼德 VH 系列分子杂交仪及紫外交联模块构建的核酸分子杂交技术体系，在乙肝病毒 DNA 检测中展现出精准的温控能力、高效的交联效率、良好的多模态适配性和可靠的检测性能。该技术不仅能准确定性检测 HBV DNA，还与病毒载量具有良好的相关性，为乙肝的临床诊断、疗效评估和病情监测提供了有力的技术支持。其智能化、高通量的特点，符合现代分子诊断实验室的需求，有望成为乙肝病毒检测的重要手段，在传染病防治领域发挥重要作用。随着技术的不断优化和完善，该检测体系将在精准医疗中展现出更广阔的应用前景。

参考文献

1. 应用DNA分子杂交技术检测乙型肝炎病毒DNA [J] . 温寿如 ,刘家壁 ,黄国超 . 华南预防医学 . 1990,第1期

2. 原位核酸分子杂交技术检测宫颈鳞状上皮病变HPV感染 [J] . 丘佳明 ,叶凯 ,杨之蕙 . 放射免疫学杂志 . 2009,第002期

3. 核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫的研究 [J] . 邱宝利 ,徐兴耀 ,牟志美 . 山东农业大学学报（自然科学版） . 2002,第001期

4. 应用核酸分子杂交技术检测女性CIN／VIN和浸润癌中的HPV [J] . 高基明 . 国外医学：妇产科学分册 . 1989,第004期

5. 聚合酶链反应-微孔板杂交技术用于乙型肝炎病毒DNA的检测 [J] . 邓正华 ,邓剑 ,黄荣忠 . 贵州医药 . 2001,第001期