mRNA-LNP的细胞表达和溶酶体逃逸检测方案分享

概览

实验设计

2.1 mRNA-LNP的体外评估方法：

1. 未摄取 mRNA（Cy5（-）/EGFP（-）
2. 空白（即预期无细胞的象限）（Cy5（-）/EGFP（+）
3. 已摄取了 mRNA 但尚未翻译（Cy5(+) / EGFP(-)）
4. 这两种细胞都摄取了 mRNA 并将其翻译成了蛋白质（Cy5(+) / EGFP(+)）。
   

2.2 机制研究方法：

实验步骤

1. 向 96 孔板中加入 100 μL浓度为每 100 μL 1×10⁴ 个细胞的 HepG2 细胞。在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜，使细胞附着于培养板底。

2. 用 HepG2 细胞培养基（含 10%胎牛血清和 1%青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基）将 FLuc mRNA LNPs 稀释至最终浓度为 500 ng/mL。

3. 阳性对照包括裸mRNA 或 Lipofectamine 2000 与 mRNA 的复合物。

将 1 mg/ml的FLuc mRNA 用 HepG2 细胞培养基稀释至 500 ng/ml。制备Lipofectamine 2000 mRNA 对照：在 0.6 ml的试管中，加入 5μL Lipofectamine 2000 于 25 μL的 Opti-MEM 培养基中。在另一个 0.6 ml的试管中，加入 5 μL 1 mg/ml的裸露 FLuc mRNA 于 25 μL的 Opti-MEM 培养基中。将上述溶液混合，在室温下孵育 5 分钟。用 HepG2 细胞培养基将溶液稀释至最终浓度为 500 ng/ml。

4. 阴性细胞活性对照：在 HepG2 细胞培养基中稀释 Triton X-100 以获得 1%（体积比）的 Triton，作为阴性活性对照，以确保检测准确运行。

5. 使用 2 ml的移液器将第1步中 96 孔板中的 HepG2 细胞培养基吸出并丢弃。

6. 向三个孔（A4 - C4）中加入 100 μL 500 ng/ml的来自步骤2的FLuc mRNA LNP，向八个孔（A2 - H2）中加入 100 μL新鲜的 HepG2 细胞培养基（作为 100% 细胞活性对照），向三个孔（A6 - C6）中加入 100 μL 500 ng/ml的裸 FLuc mRNA，向三个孔（F12 - H12）中加入 100 μL 1%的 Triton。在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 24 小时。

7. 进行 alamarBlue 细胞活性测定，在一个 15 ml的试管中，将 1 ml的 alamarBlue 细胞活性试剂加入到 9 ml的细胞培养基中（1：10）。

8. 使用 2 ml的吸液管将第6步中 96 孔板上的上清液吸出并丢弃。

9. 将步骤7中稀释的 alamarBlue 溶液倒入 25 ml的试剂储存器中。

10. 使用多通道移液器向步骤8中制备的平板的每个孔中加入 100 μL的 alamarBlue 溶液。

11. 将 96 孔板转移至 5%二氧化碳培养箱中，在 37°C 下孵育 2 至 4 小时。

12. 在酶标仪中读取 570 纳米处的吸光度和 600 纳米处的背景值。

13. 计算细胞活性

14. 在另一块 96 孔板中，重复步骤1至6。向每个处理过的孔中加入 100 μL Bright-Glo 荧光素酶检测缓冲液。孵育 3 分钟，然后在微孔板读数仪上读取发光值。

第 2 部分：定量评估荧光标记LNP的细胞摄取情况

关键信息：在 mRNA 脂质纳米颗粒配方中加入了 Atto-488 DOPE 分子（步骤 16）。

15. 用 HepG2 细胞培养基将细胞悬液稀释至每 100 μL 2×10⁴ 个细胞的最终浓度。在 24 孔板的每个孔中加入 400 μL细胞。每个孔的最终细胞密度应为 8×10⁴ 个细胞。在 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜，以使细胞附着于基质。

16. 使用 Atto-488 DOPE 制备 Atto-488 标记的FLuc mRNA-LNP。用细胞培养基将 Atto-488 标记的 FLuc mRNA LNPs 稀释至最终浓度为 500 ng/mL。

17. 用 2 ml的吸液管将 24 孔板中的上清液吸出并丢弃。

18. 每孔向细胞中加入 400 μL 500 ng/ml的 Atto-488 标记的FLuc mRNA LNP。向其他细胞中加入 400 μL新鲜细胞培养基（作为未染色细胞对照）。在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育 24 小时。

19. 用 DPBS 洗涤细胞三次，每次向每个孔中加入 400 μL DPBS。孵育 10 秒，然后用2 ml吸液管吸取上清液并丢弃液体。

20. 用 150 μL 2 倍浓度的胰蛋白酶 - EDTA（10 倍浓度胰蛋白酶 - EDTA 的 1:5 稀释液）使细胞分离，并在 5%二氧化碳培养箱中孵育 5 分钟。

21. 一旦所有细胞从培养板上脱落，向每个孔中加入 200 μL DPBS，然后将每个孔中的细胞转移到单独的 1.7 ml管中。

22. 用 DPBS 洗涤细胞两次，每次向每管中加入 400 μL DPBS，然后以 300g 离心 5 分钟，弃去上清液。每次洗涤后，将细胞悬浮于 200 μL DPBS 中。

23. 在流式细胞仪（如 Attune NxT 流式细胞仪）上分析样本。将前向散射光（FSC）电压设为 100，侧向散射光（SSC）电压设为 280，并根据需要进行调整，以确保能清晰观察到单细胞簇。然后选择“BL1”通道来测量样本。

23. 使用 FlowJo（或类似）软件，通过与未处理细胞对照相比具有更强荧光强度的细胞百分比或通过几何荧光平均强度来评估 Atto-488 标记的 FLuc mRNA LNPs 的摄取情况。

第 3 部分：使用荧光标记的LNP 的细胞摄取和蛋白质表达定量评估

关键在信息：将 Cy5-EGFP mRNA 封装到所需的 LNP 配方中，该配方由可离子化脂质（SM-102）、磷脂（DOPE）、胆固醇和 PEG 脂质（C14-PEG-2000）以及 Cy5-EGFP mRNA 组成，制备方法参考上期内容。

25. 在 24 孔板中，重复步骤15至22。使用流式细胞仪（如 Attune NxT 流式细胞仪）分析样本。将前向散射光（FSC）电压设为 100，侧向散射光（SSC）电压设为 280，并根据需要进行调整，以确保能清晰观察到单细胞簇。然后选择“BL1”通道和“RL1”通道来测量样本。使用 FlowJo 软件，通过将样本分为四个象限，以对照未处理细胞中荧光强度更强的细胞百分比来评估 Cy5-EGFP mRNA LNP 的摄取和表达情况。

26. 计数 HepG2 细胞数量，然后用 HepG2 细胞培养基稀释细胞悬液，使最终浓度为每 100 μL 1×104 个细胞。向每孔加入 300 μL细胞，使最终细胞密度为每孔 3×104 个细胞（在 µ-slide 8 孔盖玻片载玻片中）。在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育过夜，以使细胞附着于基质。

27. 用细胞培养基稀释 Cy5-EGFP mRNA LNP，使其最终浓度为 500 ng/mL。

28. 用 2 ml的抽吸移液管通过真空抽吸将 µ-slide 8 孔盖玻片载玻片上的上清液吸出并丢弃。

29. 向每个孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Cy5-EGFP mRNA 脂质纳米颗粒。在 5%二氧化碳培养箱中 37℃孵育 24 小时。

30. 用 DPBS 洗涤细胞两次，每次向每个孔中加入 300 μL DPBS。

31. 在 15 ml的试管中，用 DPBS 将 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀释至 1 μg/ml。向每个孔中加入 300 μL  1μg/ml的 Hoechst 33342，然后在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育 10 分钟。

32. 重复步骤30，将细胞清洗三次。

33. 向每个孔中加入 200 μL的 DPBS。

34. 通过将 µ-slide 8 孔盖玻片置于共聚焦激光扫描显微镜下进行共聚焦显微镜活细胞成像，以观察 mRNA LNP 的水平（选择“Cy5”通道）和 EGFP 表达（选择“EGFP”通道）。使用 WCIF Image J 软件处理图像，添加比例尺并合并不同通道（蓝色代表细胞核，红色代表 Cy5-mRNA，绿色代表 EGFP 蛋白）。

第4部分：内体逃逸机制研究

关键信息：为了量化细胞内 mRNA-LNP的内体逃逸能力，有必要在 LNPs 上添加一些荧光标记。使用 Atto-488 标记的 FLuc mRNA-LNP。

35. 重复步骤 26。

36. 重复步骤 16。

37. 重复步骤 28。

38. 向每个孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Atto-488 标记的荧光素酶 mRNA 脂质纳米颗粒。在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育 4 小时。

39. 重复步骤 30。

40. 在 15 ml的试管中，用细胞培养基将溶酶体示踪剂深红色稀释至最终浓度为 100 nM。

关键步骤：将细胞培养基预热至 37 摄氏度。

41. 向每个细胞孔中加入 300 μL 100 nM的稀释型溶酶体示踪剂深红色溶液，然后在 37 摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育 1 小时。

42. 重复步骤 30。

43. 在 15 ml的试管中，用 DPBS 将 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀释至 1 μg/ml。向每个孔中加入 300 μL 1 μg/ml的 Hoechst 33342，然后在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育 10 分钟。

44. 重复步骤 30。

45. 向每个孔中加入 200 μL的 DPBS。

46. 通过将 µ-slide 8 孔盖玻片置于共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像，以可视化内体（选择“Lysotracker Deep Red”通道）、细胞核（选择“Hoechst 33342”通道）和 Atto-488 标记的 FLuc mRNA LNPs（选择“Atto-488”通道）。需要拍摄五张具有代表性的细胞图像（每张图像包含超过 20 个细胞）来计算 PCC 值。这些图像可以通过 WCIF Image J 软件进一步处理，以添加比例尺并合并不同通道（蓝色：细胞核；红色：内体；绿色：Atto-488 标记的 FLuc mRNA LNPs）。要获取 PCC 值，请将共聚焦图像导入带有“JACoP”插件的 WCIF ImageJ 软件。导航至“插件”，选择“JACoP”，然后选择“皮尔逊相关系数”。选择图像 A（绿色通道）和图像 B（红色通道），然后点击“分析”。软件将计算 PCC 值。内体逃逸能力通过 PCC 进行量化，其中 PCC 值为 1 表示无内体逃逸，而 PCC 值为 0 表示充分内体逃逸。

第5部分：使用巴弗洛霉素 A1 评估质子海绵机制

关键信息：为了量化细胞内 mRNA-LNP的内体逃逸能力，有必要在 LNPs 上添加一些荧光标记。使用 Atto-488 标记的 FLuc mRNA-LNP。

47.重复步骤35至37，但在步骤36中，按照实验步骤制备未标记荧光素的 FLuc mRNA LNP。

48. 向三个孔中加入 180 μL新鲜的 HepG2 细胞培养基，向另外三个孔中加入含有巴弗洛霉素 A1（111.1 nM）的新鲜 HepG2 细胞培养基。

49. 在 1.7 ml的试管中，称取 1.5 mg的钙黄绿素，然后加入 1 ml的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），使钙黄绿素的最终浓度为 1.5 mg/ml。

50. 向每个孔中加入 20 μL 1.5 mg/ml的钙黄绿素，以获得 150 μg/ml的钙黄绿素和 100 nM的巴弗洛霉素 A1 的最终浓度。

51. 向每个孔中加入 100 μL 1500 ng/ml的 mRNA 脂质纳米颗粒（以获得最终浓度为 500 ng/ml的 mRNA 脂质纳米颗粒）。向对照细胞中加入 100 μL新鲜培养基。在 37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育 4 小时。

52. 在 4 小时的孵育期结束后，用户可选择用 CellMask™ Deep Red Actin 跟踪染料（方案 A）对细胞骨架进行染色，或用 Hoechst 33342（方案 B）对细胞核进行染色，以分别观察细胞骨架和细胞核。

（A）染色细胞骨架

（i）在 15 ml的试管中，用细胞培养基将 CellMask™ Deep Red Actin 跟踪染料（1 毫摩尔）稀释至最终浓度为 1 微摩尔。

（ii）向每个处理过的孔中加入 300 μL 1 微摩尔的稀释 CellMask™ Deep Red Actin 跟踪染料。

（iii）在 5% CO2 培养箱中 37°C 孵育 15 分钟。

（B）染色细胞核

（i）用 Hoechst 33342 染色细胞核，请重复步骤 54。

53. 用 DPBS 洗涤细胞四次，重复步骤30。

54. 向每个孔中加入 200 μL的 DPBS。

55. 通过将 µ-slide 8 孔盖玻片置于共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像，以共聚焦显微镜观察钙黄绿素信号（选择“钙黄绿素”通道）、细胞核（选择“Hoechst 33342”通道）和细胞骨架（选择“CellMask Deep Red”通道）。图像可通过 WCIF Image J 软件进一步处理，以添加比例尺或合并不同通道（蓝色：细胞核；红色：细胞骨架；绿色：钙黄绿素）。

预期结果

在HepG2 细胞的 FLuc 表达评估中，所有 mRNA LNPs 的耐受性均如预期般良好（图3a），1%的 Triton X-100 使细胞存活率低于 10%，这表明 alamarBlue 细胞活力测定法有效。在蛋白质表达方面，ATP LNPs 的 FLuc 表达量高于其他配方，而 TAT LNPs 和八精氨酸 LNPs 的 FLuc 表达量较低（图3b）。为了评估细胞摄取情况，利用 Atto-488 标记的 DOPE制备LNP ，并量化与培养基处理对照组相比荧光信号增强的细胞百分比。TAT LNPs、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 的细胞摄取量低于 LNP 组（图3c）。将 Cy5-EGFP mRNA 封装到 LNP ，蛋白质表达和细胞摄取可通过流式细胞术进行定量评估（图3d、e），所得结果与图3b、c 中的结果相似。通过这种方法，可以同时评估蛋白质表达和细胞摄取。为了定性评估蛋白质表达和细胞摄取，可使用共聚焦显微镜可视化 Cy5-EGFP mRNA LNPs，为研究人员提供更直观、直接的 mRNA LNPs 效果评估方式。如图3f 所示，ATP LNPs 表现出更高的蛋白质表达，而 TAT LNPs、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 则表现出较低的蛋白质表达，这与图3d、e 中的结果一致。

参考文献：Ma Y, VanKeulen-Miller R, Fenton OS. mRNA lipid nanoparticle formulation, characterization and evaluation. Nat Protoc. 2025 Mar 11. doi: 10.1038/s41596-024-01134-4. Epub ahead of print. PMID: 40069324.