蛋白免疫检测技术

蛋白免疫检测技术是基于抗原与抗体特异性结合的原理，用于检测生物样品中蛋白质的存在、含量、分布及相互作用的一类分析技术。这类技术具有高特异性、高灵敏度等特点，广泛应用于医学诊断、生物学研究、药物开发等领域。以下是几种常见的蛋白免疫检测技术及其原理、应用和特点：

一、酶联免疫吸附测定（ELISA）

原理

将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）表面，通过酶标记的抗原或抗体与待测样品中的目标蛋白结合，加入底物后酶催化显色反应，通过吸光度值定量分析目标蛋白。

类型

1. 直接法：标记抗体直接结合抗原。

2. 间接法：用未标记的一抗结合抗原，再用酶标记的二抗检测一抗。

3. 夹心法：用捕获抗体固定抗原，再用酶标记的检测抗体结合抗原，适用于双表位抗原的定量。

4. 竞争法：待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，用于小分子抗原检测。

应用

• 医学诊断：检测病原体抗体（如 HIV、乙肝病毒）、肿瘤标志物（如 CEA）。

• 科研：细胞因子、激素等微量蛋白的定量分析。

点

灵敏度高（pg-ng 级）、操作简便、可高通量检测。

缺点

可能存在非特异性结合，需设置严格对照；仅能检测可溶性蛋白。

二、免疫印迹法（Western Blot，WB）

原理

1. 电泳分离：通过 SDS-PAGE 电泳按分子量分离蛋白样品。

2. 转膜：将蛋白转移到固相膜（如 PVDF 膜、硝酸纤维素膜）上。

3. 免疫反应：用一抗和酶 / 荧光标记的二抗结合目标蛋白，通过化学发光或显色剂显影。

   
   

应用

• 验证蛋白表达（定性或半定量），分析蛋白分子量及修饰（如磷酸化、糖基化）。

• 检测细胞或组织中的特异性蛋白（如癌症相关蛋白）。

  
  

优点

缺点

操作步骤繁琐，耗时较长；定量准确性低于 ELISA。

三、免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）

原理

用荧光素（如 FITC、Alexa Fluor）标记抗体，与细胞或组织中的目标蛋白结合，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察荧光信号，定位蛋白在细胞内的分布（如细胞膜、细胞质、细胞核）。

类型

• 直接免疫荧光：标记一抗直接结合抗原。

• 间接免疫荧光：未标记一抗结合抗原，再用荧光标记的二抗检测，信号更放大。

  
  

应用

• 细胞生物学：研究蛋白亚细胞定位、动态变化（如细胞骨架蛋白、受体分布）。

• 自身抗体检测：如抗核抗体（ANA）的荧光显微镜诊断。

  
  

优点

直观显示蛋白空间分布，可实现多色标记（同时检测多种蛋白）。

缺点

需荧光显微镜，样品制备要求高；荧光信号可能随时间衰减。

四、免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）

原理

将组织样本制成切片（如石蜡切片、冰冻切片），用抗体检测组织中目标蛋白的定位和表达水平，通过酶显色（如 DAB 显色呈棕黄色）或荧光标记显示结果。

应用

• 病理诊断：鉴别肿瘤类型（如乳腺癌 ER/PR 检测）、判断预后（如 Ki-67 增殖指数）。

• 研究组织中蛋白的分布特征（如炎症因子在组织中的表达）。

  
  

优点

保留组织形态学结构，便于结合病理特征分析。

缺点

结果判读依赖经验，定量准确性较低。

五、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

原理

应用

• 研究蛋白 - 蛋白相互作用（如免疫共沉淀 Co-IP）。

• 富集低丰度蛋白，用于结构或功能研究。

优点

缺点

需高亲和力抗体，操作需优化避免非特异性结合。

六、流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）

原理

应用

• 免疫学：免疫细胞分型（如 T 细胞亚群 CD4+/CD8 + 检测）。

• 癌症研究：细胞周期、凋亡相关蛋白分析。

优点

缺点

需流式细胞仪，样品需制备成单细胞悬液。

七、化学发光免疫分析（CLIA）

原理

应用

临床检测：激素（如甲状腺激素）、肿瘤标志物的高灵敏度定量。

优点

灵敏度高于 ELISA（fg 级），自动化程度高，适合大规模检测。

技术发展趋势

1. 多重检测：如流式细胞术、多色免疫荧光可同时检测多种蛋白。

2. 自动化与高通量：ELISA、CLIA 的全自动检测平台提高效率。

3. 高分辨率成像：超分辨率显微镜结合免疫荧光技术，解析蛋白纳米级分布。

4. 单细胞技术：单细胞免疫荧光、流式细胞术实现单细胞水平异质性分析。

这些技术各有侧重，实际应用中需根据检测目的（定性 / 定量 / 定位）、样品类型（细胞 / 组织 / 体液）及灵敏度要求选择合适的方法，或结合多种技术进行综合分析。

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