北京大学人民医院胃肠外科团队发现CTSD N-糖基化修饰影响结直肠癌肝转移

研究背景：

结直肠癌是全球五大致命癌症之一，在中国是第二大常见恶性肿瘤。肝转移是患者预后不良的主要原因，25%的患者初诊时已有肝转移，

术后15%-25%因肝转移复发，90%的肝转移患者无法获得有效治疗，IV期患者5年生存率仅24%。N-糖基化修饰在蛋白质的多种功能中起关键作用，

且与恶性肿瘤转移相关，但目前关于结直肠癌肝转移相关的N-糖基化蛋白质组学研究较少。

研究方法：

收集14例结直肠癌肝转移患者的原发性病灶和配对肝转移病灶样本，经处理后进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。对多种细胞系进行培养，

构建CTSD突变体，通过转染、感染等操作，进行细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等实验。构建裸鼠皮下肿瘤和肝转移模型，观察肿瘤生长和

转移情况。

主要研究结果：

1. CRC患者肝转移性病变表现出比原发性病变更高的CTSD N-糖基化水平

通过质谱技术，研究人员对比了14例原发性病灶和14例配对肝转移病灶的N-糖基化修饰差异，共检测到139种N-糖基化蛋白、185个N -糖基化

修饰位点、490个完整结构的N-糖肽以及71种糖基。其中46个N-糖基化修饰位点此前未被Uniprot平台报道。在肝转移病灶中，有13个位点的

N-糖基化修饰水平变化超过1.5倍。N-糖基化位点周围的氨基酸序列具有一定保守性。44.94%的N-糖基化位点被单一、固定的糖基修饰，

20.86%的N-糖蛋白含有多个N-糖基化修饰位点。借助GO和KEGG分析发现，这些N-糖基化蛋白可能属于分泌蛋白和膜蛋白。在生物学过程方面，

主要参与细胞间粘附、蛋白水解和免疫反应等；分子功能则主要与结合活性相关。KEGG通路富集分析表明，它们可能涉及溶酶体、

细胞外基质-受体相互作用以及药物-受体等相关途径。此外，在 Cathepsin D（CTSD）的第263位残基处，发现 2488.06545（PrecursorMH）

作为H (6) N (2) 糖基的结构修饰，在肝转移病灶相对于原发性病灶的修饰变化倍数绝对值最高。同时，H (5) N (2)和H (7) N (2)的

N-糖基化修饰水平在肝转移病灶中也显著增加，这表明肝转移病灶中CTSD第263位残基的N-糖基化修饰水平整体高于原发性病灶。

图1结直肠癌原发性病灶和配对肝转移病灶中N - 糖基化蛋白的相关分析

2. CTSD糖基化修饰特征及相关位点突变对蛋白的影响

对5例CRC患者的原发性病灶和配对肝转移病灶进行检测，发现肝转移病灶中CTSD的N -糖基化水平高于原发性病灶。同时，

在多种CRC细胞系中评估CTSD的糖基化水平，CTSD在不同CRC细胞系中的糖基化水平存在差异。使用PNGase F和衣霉素处理细胞系后，

CTSD 的分子量下降，表明CTSD存在N-糖基化修饰，且经处理后从糖基化形式转变为非糖基化形式。分析发现CTSD在

天冬酰胺残基 263（N263）处具有进化保守性。UniProt 蛋白数据库预测CTSD有2个潜在N-糖基化位点（天冬氨酸残基134和263）。

随后在SW480和 SW620 细胞系中沉默内源性CTSD 表达，再分别转导编码野生型 CTSD（CTSD WT）或突变型CTSD

（CTSD N263Q、CTSD N134Q/N263Q）的外源质粒，成功构建稳定表达细胞模型。通过对比突变前后及经 PNGase F 处理后的CTSD

分子量变化，确定CTSD仅在残基 134和263处存在N-糖基化修饰位点。

图2 CTSD N-糖基化修饰位点验证

3. CTSD N263位点糖基化修饰促进CRC生长和转移

将CTSD野生型（WT）和N263Q突变型（非糖基化）的SW480细胞分别皮下注射至裸鼠，成瘤实验的结果表明CTSD WT组肿瘤体积显著

大于N263Q组，且肿瘤外观更明显、重量更重。在肝转移裸鼠模型中，WT组裸鼠肝脏表面可见明显转移结节，而N263Q组肝脏无肉眼可

见转移灶；HE染色显示WT组肝脏存在典型转移灶，N263Q组肝脏组织正常，无转移迹象，表明CTSD在N263位点的N -糖基化修饰是其

促进CRC生长和肝转移的关键因素，缺失该修饰（N263Q突变）会导致肿瘤增殖能力下降、皮下肿瘤生长速度显著减慢、转移潜能丧失。

图3 CTSD N263位点糖基化修饰位点验证对CRC生长和转移的影响

4. CTSD N-糖基化修饰对其细胞定位、稳定性及功能活性的影响

GeneCards显示CTSD主要分布于细胞外基质、溶酶体和内体。免疫荧光实验发现野生型（WT）CTSD与溶酶体标记物LAMP1、早期

内体标记物EEA1、晚期内体标记物Rab7共定位，表明其正常运输至溶酶体和内体；而突变体（N263Q、N134Q/N263Q）CTSD全丧失与

上述标记物的共定位能力，滞留于细胞质或错误定位。单突变体（N263Q）CTSD分泌量显著低于WT细胞，提示N263糖基化缺失抑制其分泌；

而双突变体（N134Q/N263Q）CTSD 分泌量反而高于WT细胞，表明双位点糖基化缺失可能解除某种分泌抑制机制。环己酰亚胺（CHX）

追踪显示WT CTSD在处理5小时后仍保持较高水平，半衰期较长，N263Q 突变体CTSD在处理3小时后显著降解，半衰期缩短。使用CTSD

特异性底物（GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2）和荧光法检测发现，WT CTSD的酶活性显著高于N263Q和N134Q/N263Q 突变体，双突变体

酶活性低，单突变体次之，表明糖基化位点数量与酶活性呈正相关。这表明N263糖基化是CTSD进入溶酶体/内体的必要条件，确保其在

酸性环境中发挥功能，糖基化抑制蛋白降解，延长CTSD的半衰期，并直接影响CTSD的催化效率，促进其蛋白酶功能。此外，N263位点在

定位和稳定性调控中起主导作用，而N134可能通过协同作用影响分泌和酶活。

图4 CTSD第134和263位的N-糖基化调节其折叠位置、稳定性和功能活性

5. CTSD N-糖基化修饰的调控机制研究

随后探究了 CTSD的N-糖基化修饰的调控机制，重点鉴定了参与其糖基化的转移酶复合体及关键亚基。利用FLAG标签富集CTSD

野生型（WT）和N263Q突变体的互作蛋白，通过质谱分析差异结合蛋白，发现CTSD WT特异性结合235种蛋白，N263Q结合191种蛋白，

其中45种蛋白仅与WT互作，其中DDOST是唯的N -糖基转移酶。N -糖基化起始于内质网中的寡糖转移酶（OST）复合体，分为OST-A

（催化亚基 STT3A）和OST-B（催化亚基STT3B），非催化亚基如DDOST可稳定复合体与底物的结合。随后，通过CPTAC数据库

分析发现，STT3A、STT3B和DDOST在结肠癌组织中均显著高表达，提示其与CRC进展相关。在SW480 细胞中敲除STT3B或DDOST后，

CTSD分子量显著降低，表明N- 糖基化修饰缺失；而敲除STT3A无明显变化。免疫共沉淀验证发现，CTSD WT与STT3B、DDOST

显著互作，而N263Q突变体与两者的结合能力明显减弱，CTSD与STT3A无明显结合，表明STT3B是主要催化亚基。此外，免疫荧光共

定位的结果表明CTSD与STT3B、DDOST在细胞质和内质网区域显著共定位，而与STT3A无共定位。

图5 CTSD N-糖基转移酶鉴定

6. CTSD的N-糖基化修饰通过降解ACADM、调控铁死亡促进CRC肝转移的分子机制

通过比较CTSD野生型（WT）和N263Q突变型SW480 细胞的蛋白质组，筛选鉴定出391个差异表达蛋白（DEPs），其中WT中高表达的蛋白

主要富集于蛋白酶活性、细胞迁移等通路，N263Q中高表达的蛋白涉及脂肪酸代谢、抗氧化反应等，通过CTSD WT特异性互作蛋白与

DEPs的交集分析，初步筛选出8个候选分子：ACADM、PRDX3、ALDH2、EHHADH、DHCR7、TGFB1I1、IDH2、ALDH1A1。临床

相关性分析显示，ACADM和PRDX3高表达患者的预后显著优于低表达者，提示两者可能为抑癌因子；TNM 分期分析发现ACADM表达随

CRC恶性程度（TNM分期）进展而降低，在肝转移（IV 期）患者中表达低，表明 ACADM与转移负相关，因此选为后续研究靶点。

在CTSD WT和N263Q细胞中，CTSD表达水平相当，但N263Q细胞的ACADM蛋白水平显著升高，提示CTSD糖基化促进 ACADM 降解。

此外，Co-IP的结果表明CTSD WT与ACADM显著结合，而N263Q突变体无法与 ACADM互作，表明CTSD的N263糖基化是其结合并降解

ACADM的前提。最后，在90 例CRC组织中，CTSD 表达与ACADM 呈显著负相关，且两者在细胞质中共定位，进一步验证 CTSD 对

ACADM 的降解作用在临床样本中普遍存在。

图6 CTSD N263-糖基化修饰影响CTSD蛋白酶对ACADM的蛋白水解作用

研究结论：

本研究聚焦结直肠癌肝转移中N-糖基化修饰机制，CTSD的N263位点糖基化在肝转移灶中显著上调，该修饰由STT3B和DDOST糖基转移酶

复合体调控。CTSD糖基化通过维持其溶酶体定位、稳定性及蛋白酶活性，促进降解ACADM蛋白，进而调控铁死亡相关蛋白（ACSL4、

SLC7A11、GPX4），增强CRC细胞侵袭转移能力。体内实验显示，敲除N263 糖基化可抑制裸鼠肿瘤生长及肝转移。该研究揭示CTSD-N263

糖基化通过“STT3B/DDOST-ACADM-铁死亡轴” 驱动转移，为CRC治疗提供了新靶点与理论依据。

研究思维导图：

参考文献：

Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39716927; PMCID: PMC11831497.