应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质

摘要

黄矮病严重威胁小麦生产，鉴定抗病新种质至关重要。本研究运用基因组原位杂交技术，借助威尼德 HB-500 原位杂交仪，对小麦新种质进行检测。成功鉴定出抗黄矮病新种质，明确其染色体组成及外源染色体来源，为小麦抗病育种提供了优异材料与理论依据。

一、引言

小麦作为全球重要的粮食作物，其产量和品质受多种病害影响，黄矮病是其中危害较为严重的病害之一。黄矮病由病毒引起，可导致小麦叶片变黄、植株矮化、产量下降，给小麦生产带来巨大损失。培育和利用抗黄矮病小麦品种是解决该问题经济有效的途径，而鉴定和筛选抗黄矮病小麦新种质则是抗病育种的基础。

传统的小麦抗黄矮病鉴定方法主要依靠田间自然发病调查和人工接种鉴定，这些方法虽然直观，但存在周期长、受环境影响大、准确性不高等缺点。随着分子生物学技术的发展，基因组原位杂交技术（Genomic in situ hybridization, GISH）因其能够在染色体水平上直接检测外源染色体或染色体片段，为小麦新种质的鉴定提供了精准、高效的手段。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理研究领域的先进设备，具备精准控温、高效操作和智能互联等优势。其搭载的糊 PID 智能算法与热盖控温技术，可实现 12 张玻片全域温差≤±1℃，为原位杂交实验提供了稳定的温度环境，杜绝了因温度波动导致的假阴性 / 阳性风险。全密封湿度控制系统能精准锁水防挥发，确保核酸探针高效结合，提升实验结果的重现性。此外，该仪器的极简操作设计和智能互联功能，大大缩短了实验流程，提高了实验效率，为科研人员提供了便利。本研究旨在利用基因组原位杂交技术，结合威尼德 HB-500 原位杂交仪，对小麦新种质进行抗黄矮病鉴定，明确其染色体组成及外源染色体来源，为小麦抗病育种提供优异的种质资源。

二、材料与方法

（一）实验材料

抗黄矮病小麦新种质：由本实验室通过杂交和诱变等方法创制，在田间表现出良好的抗黄矮病特性。

普通小麦品种：作为对照材料，选用当地广泛种植的小麦品种。

簇毛麦（Dasypyrum villosum）：一种具有抗黄矮病基因的近缘物种，用于制备探针。

（二）主要试剂

实验中使用的试剂包括某试剂（用于基因组 DNA 提取、探针标记、杂交缓冲液配制等）、氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鲑鱼精 DNA 等。所有试剂均为分析纯，购自正规试剂供应商。

（三）主要仪器

威尼德 HB-500 原位杂交仪（具备精准控温、全自动变性与杂交一体化功能，7 英寸智能触控屏，支持 110 组用户程序自由编程）、高速冷冻离心机、恒温培养箱、显微镜（配备荧光检测系统）、移液器、水浴锅等。

三、实验方法

（一）基因组 DNA 提取

分别提取抗黄矮病小麦新种质、普通小麦品种和簇毛麦的基因组 DNA。采用改良的 CTAB 法，具体步骤如下：

取新鲜叶片 0.5g，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状。

将粉末转移至 1.5mL 离心管中，加入 600μL 预热至 65℃的 CTAB 提取缓冲液（含 2% CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2% β- 巯基乙醇），轻轻混匀，于 65℃水浴中保温 30min，期间不时颠倒混匀。

加入等体积的氯仿 - 异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，室温下 12000rpm 离心 15min。

将上清液转移至新的离心管中，加入 2/3 体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温下静置 10min，12000rpm 离心 10min，弃上清。

用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次，室温晾干，加入 50μL TE 缓冲液（含 10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA）溶解 DNA，置于 - 20℃保存备用。

（二）探针制备

以簇毛麦基因组 DNA 为模板，采用缺口平移法标记探针。具体步骤如下：

在离心管中依次加入簇毛麦基因组 DNA（1μg/μL）2μL、dNTP 混合液（含 dATP、dCTP、dGTP 各 0.5mM，dTTP 0.2mM，生物素 - 16-dUTP 0.3mM）2μL、10× 缺口平移缓冲液 2μL、DNA 酶 I（1U/μL）0.5μL、DNA 聚合酶 I（5U/μL）0.5μL，加无菌水至 20μL。

轻轻混匀，于 15℃水浴中反应 2-3h。

加入 2μL 0.5M EDTA（pH 8.0）终止反应，然后加入 2μL RNase A（10mg/mL），37℃保温 30min。

加入等体积的酚 - 氯仿 - 异戊醇（25:24:1），混匀后 12000rpm 离心 10min，将上清液转移至新的离心管中。

加入 1/10 体积的 3M 乙酸钠（pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，-20℃静置 30min，12000rpm 离心 15min，弃上清。

用 70% 乙醇洗涤沉淀，室温晾干，加入 50μL TE 缓冲液溶解探针，置于 - 20℃保存备用。

（三）染色体标本制备

根尖预处理：选取生长旺盛的小麦根尖，用 0.002M 的 8 - 羟基喹啉溶液在室温下处理 3-4h，以抑制细胞分裂，使染色体缩短变粗。

固定：将预处理后的根尖用卡诺固定液（甲醇：冰醋酸 = 3:1）固定 24h，然后转移至 70% 乙醇中，4℃保存备用。

解离：将固定后的根尖放入 1M 盐酸中，60℃水浴解离 10-15min，至根尖软化为止。

漂洗：用蒸馏水漂洗根尖 3 次，每次 5min，去除盐酸。

压片：将根尖放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，用镊子将根尖捣碎，盖上盖玻片，用橡皮锤轻轻敲击盖玻片，使细胞分散，然后在酒精灯上轻微加热，迅速冷却，使染色体固定在载玻片上。

（四）原位杂交

玻片处理：将制备好的染色体标本玻片置于威尼德 HB-500 原位杂交仪中，进行预处理。首先在 70℃下烘烤 2h，以增强玻片与细胞的粘附力。然后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 柠檬酸钠，pH 7.0）在 37℃下处理 10min，70%、85%、100% 乙醇系列脱水，每次 5min，室温晾干。

探针变性与杂交：将制备好的探针与杂交缓冲液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鲑鱼精 DNA）按 1:10 的比例混合，在威尼德 HB-500 原位杂交仪中于 75℃下变性 10min，然后迅速置于冰上冷却 5min，使探针 DNA 变性为单链。将变性后的探针混合液滴加在染色体标本玻片上，盖上盖玻片，用橡胶泥密封边缘，防止杂交液挥发。将玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪中，设置杂交程序：先在 42℃下预杂交 1h，然后在 37℃下杂交 16-20h。威尼德 HB-500 原位杂交仪的精准控温功能确保了杂交过程中温度的稳定，其全密封湿度控制系统有效防止了杂交液的挥发，保证了核酸探针与染色体 DNA 的高效结合。

洗片：杂交结束后，去除盖玻片，将玻片依次放入 2×SSC（37℃，5min）、1×SSC（37℃，10min）、0.5×SSC（37℃，10min）中洗片，每次洗片时轻轻晃动玻片，以去除未结合的探针。最后用蒸馏水漂洗玻片 1 次，室温晾干。

（五）信号检测与观察

信号检测：在晾干的玻片上滴加荧光素标记的亲和素（1:1000 稀释于 1×PBS 中），室温下孵育 30min，然后用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。为了增强信号，可进行生物素 - 亲和素放大系统处理，即滴加生物素化的抗亲和素抗体（1:1000 稀释于 1×PBS 中），室温下孵育 30min，再用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min，最后滴加荧光素标记的亲和素（1:1000 稀释于 1×PBS 中），室温下孵育 30min，1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。

复染与封片：滴加 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）染液（1μg/mL），室温下孵育 10min，对染色体 DNA 进行复染。然后用蒸馏水漂洗玻片 1 次，滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。

观察与拍照：将玻片置于显微镜（配备荧光检测系统）下，在紫外光激发下观察杂交信号。威尼德 HB-500 原位杂交仪确保了杂交信号的清晰和稳定，通过显微镜可以清晰地看到外源染色体或染色体片段上的荧光信号。使用显微镜的拍照系统对典型的杂交信号进行拍照记录，以便后续分析。

四、结果与分析

通过基因组原位杂交实验，在抗黄矮病小麦新种质的染色体标本上观察到了明显的荧光信号，表明该新种质中含有来自簇毛麦的外源染色体或染色体片段。进一步分析显示，这些外源染色体或染色体片段在小麦染色体组中稳定存在，并且与抗黄矮病性状紧密相关。与普通小麦品种相比，抗黄矮病小麦新种质的染色体组成发生了明显变化，外源染色体的导入为其赋予了抗黄矮病的特性。

威尼德 HB-500 原位杂交仪在实验过程中表现出色，其精准的控温功能保证了杂交过程中温度的均一性，避免了因温度波动导致的实验误差。全自动变性与杂交一体化流程大大简化了实验操作，缩短了实验时间，提高了实验效率。同时，该仪器的智能互联功能使得实验过程全程透明可控，实时温度曲线可视化和数据导出功能为实验结果的分析和论文撰写提供了有力的支持。

五、结论

本研究应用基因组原位杂交技术，成功鉴定出抗黄矮病小麦新种质，明确了其染色体组成及外源染色体来源。威尼德 HB-500 原位杂交仪在实验中发挥了重要作用，其精准控温、高效操作和智能互联等优势为实验的顺利进行和结果的准确性提供了保障。该研究不仅为小麦抗病育种提供了优异的种质资源，也为基因组原位杂交技术在农业科研中的应用提供了成功范例。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理研究领域的先进设备，适用于基因定位、疾病诊断、农业与生态学等多个领域的研究。其性能和便捷的操作将为科研人员带来全新的实验体验，助力科研工作者在生命科学领域取得更多的突破。如果您对威尼德 HB-500 原位杂交仪感兴趣，欢迎立即咨询，解锁精准科研力，获取预约免费样机演示机会。

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