动脉粥样硬化中血流诱导的内皮细胞重编程

Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis

Subject terms: Cell biology, Systems biology

动脉粥样硬化是一种主要影响动脉的多因素慢性炎症性疾病。内皮细胞功能障碍和炎症在动脉粥样硬化的发生和进展中起着至关重要的作用。血管内层的内皮细胞与血液直接接触，并因各种风险因素（如高胆固醇血症、糖尿病、高血压、吸烟和衰老）而变得功能失调和发炎，尤其是在与血流紊乱相关的特定动脉粥样硬化易发区域。这些区域的扰动流的特征是向内皮细胞表面传递低幅度的振荡剪切应力（OSS）。内皮细胞通过机械感应受体（机械传感器）检测各种剪切应力模式和幅度，并将这些机械信号转化为细胞信号和随后的结构和功能反应。

在这些内皮炎症部位，循环单核细胞与内皮细胞结合并迁移到内皮下空间，分化成巨噬细胞。这些区域还显示出对循环低密度脂蛋白（LDL）胆固醇的渗透性增加，LDL 胆固醇在内皮下被氧化并被附近的巨噬细胞摄取，从而促进泡沫细胞发育并引发炎症和巨噬细胞积累的恶性循环。此外，这些区域的血管平滑肌细胞（VSMCs）转化为合成表型并迁移到内皮下层增殖，导致动脉壁增厚。一些 VSMCs 转化为泡沫细胞，最终导致脂质条纹和纤维脂肪斑块的形成（图1 a）。随着动脉粥样硬化斑块向外和向内生长、成熟和进展，一些斑块破裂，导致严重的心血管事件，如心肌梗塞和中风。

目前，控制致动脉粥样硬化内皮细胞功能障碍和炎症的血流调控（血流敏感）的基因、蛋白质和通路可能成为有希望的新治疗靶点。为此，美国埃默里大学-佐治亚理工Wallace H. Coulter生物医学工程系团队的一项综述讨论了当前关于血流敏感基因、蛋白质和通路的研究进展，包括与内皮功能障碍和动脉粥样硬化有关的紊乱血流诱导的内皮细胞重编程（FIRE）的新兴概念。研究成果发表于 Nature Reviews Cardiology 期刊题为“Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis”。

图1    动脉粥样硬化优先发生在血流紊乱的部位。

内皮细胞的剪切应力

血管内皮细胞不断暴露在血流动力学力下：血压引起的动脉壁正常（跨壁）应力和周向应力，以及血流引起的内皮表面的切向剪切应力（图1 b）。虽然血管壁中的跨壁压力和周向应力主要影响和调节内侧 VSMCs，但流体剪切应力主要影响内皮细胞，有效调节其功能。

由于复杂的血管几何形状和血流动力学条件，血管系统不同区域的剪切应力水平和方向模式差异很大（图1 c）。在人体动脉的直段、非分支区域，血流的粘性力超过惯性力，导致稳定的单向层流，从而向内皮细胞提供高幅度的 ULS （~15 dyn/cm2）。相反，在弯曲和分支区域，惯性力变得更加突出，导致紊乱的多向振荡流，将低幅度的 OSS（约 ±4 dyn/cm2）输送到内皮细胞表面（图1 d）。

血流的临床意义在于，动脉粥样硬化优先发生在弯曲或分支的血管区域，这些区域暴露于流动受干扰的环境，并存在其他危险因素，如高胆固醇血症和糖尿病。

血流诱导的动脉粥样硬化的动物模型

临床观察强烈表明，血流紊乱与动脉粥样硬化发生部位之间存在相关性，但其是否直接导致动脉粥样硬化一直是未知的，直到在动物模型的实验研究中得到证实。在部分颈动脉结扎术（PCL）模型中，左颈动脉（LCA）诱导血流紊乱，具有典型的低幅度 OSS 模式（图2 a）。在高脂饮食诱导高胆固醇血症的Apoe−/− 小鼠或过表达PCSK9的C57BL/6小鼠中，PCL 手术在 2-3 周内导致整个 LCA 长度的动脉粥样硬化快速发展。重要的是，在该小鼠模型中，对侧右颈动脉（RCA）继续暴露于稳定的血流中，且不会形成动脉粥样硬化斑块，是同一动物的理想对照（图2 b）。此外，收缩颈动脉袖带模型涉及在 RCA 的一部分上植入剪切应力修改模型（图2 b），它将 RCA 的该部分暴露于三种不同的剪切应力状态下：低幅度、稳定的血流，这会诱导易损斑块的发展；高幅度、稳定的血流，无斑块形成；以及紊乱血流，这会导致稳定性斑块的发展。该小鼠模型显示了单颈动脉内血流依赖性动脉粥样硬化的发展（图2 b）。这两种动物模型已在全球众多实验室中使用，是研究体内血流依赖性内皮细胞功能和动脉粥样硬化机制的极其有价值的工具。

除了这些受干扰血流诱导的动脉粥样硬化的小鼠模型外，斑马鱼也被用作一种遗传上易于处理的模型，用于检查动脉粥样硬化发生的早期事件。结合基因操作方法减少血流量，斑马鱼模型提供了进一步的证据，证明在高胆固醇血症条件下，血流紊乱会导致动脉粥样硬化。

此外，已经开发了许多剪切应力的体外模型，包括锥板粘度计、平行板流室和微流体通道。这些体外生物反应器将内皮细胞暴露在各种剪切条件下，可用于在明确的生物力学环境中确定剪切应力依赖性内皮功能的详细机制（图2 c、d）。

图2    血流紊乱诱导的动脉粥样硬化模型。

血流调节内皮功能

体内内皮细胞不断暴露于各种血流动力学因素，尤其是与血流相关的剪切应力，它有效地调节了内皮细胞功能的几乎所有方面。明确稳定血流保护内皮稳态功能和紊乱血流诱导内皮功能障碍的机制对于了解血流依赖性动脉粥样硬化的发病机制和开发新的治疗方法至关重要。

稳定流通过控制紧密连接蛋白表达和与肌动蛋白细胞骨架的附着来促进紧密连接稳定性，以及通过 VE-钙粘蛋白的磷酸化和降解来控制粘附连接完整性，从而调节内皮细胞通透性。扰动流通过多种机制增加内皮细胞增殖和细胞凋亡，包括下调肿瘤抑制蛋白 p53 的表达和抑制抗凋亡激酶AKT。稳定流通过 sirtuin 1 依赖性和 FOXO1 依赖性通路诱导自噬，为内皮细胞提供细胞保护机制。扰动流通过 p53 依赖性和 sirtuin 1 依赖性机制诱导内皮细胞衰老，从而减少内皮细胞迁移并破坏动脉修复机制。

血流还调节内皮细胞的新陈代谢和氧化还原反应。虽然稳定血流会降低内皮葡萄糖摄取和代谢活性以及编码糖酵解相关蛋白质的基因的表达，但紊乱血流会促进糖酵解代谢，导致明显不同的代谢组学特征和线粒体裂变增加。扰动流还增加了内皮活性氧（ROS）的生成和氧化应激。在动脉粥样硬化和高血压的情况下，内皮响应扰动流的ROS 生成会增加血管氧化应激和 LDL 氧化。

血流紊乱还有效诱导内皮细胞炎症和内皮细胞的转分化，这在动脉粥样硬化的发生和发展中起着至关重要的作用。扰动流通过增加内皮粘附分子（VCAM1、ICAM1 和 E-选择素）的表达来诱导内皮炎症，这些分子介导单核细胞与内皮细胞的粘附。此外，扰动流促进了细胞因子和趋化因子的表达，如 IL-1、IL-6 和 CCL5。血流紊乱可诱导内皮细胞向间充质细胞的转分化（内皮细胞到间充质细胞的转变；EndMT）和免疫样细胞（内皮细胞到免疫细胞转变；EndIT）。

机械传感器和机械转导

内皮细胞通过位于细胞顶端和基底表面、细胞间连接处和细胞内的机械传感器识别流体剪切应力（图3）。在顶端表面，机械传感器包括质膜蛋白，如阳离子通道 PIEZO1 和 P2X 嘌呤受体4、NOTCH1、蛋白激酶、G 蛋白偶联受体和丛状蛋白D1，以及膜相关结构，如小窝、糖萼和初级纤毛。

在细胞间连接处，血小板内皮细胞粘附分子（PECAM1）、VE-钙粘蛋白和 VEGFR2 形成连接机械感觉复合物，该复合物通过 PI3K-AKT 信号介导整合素激活、细胞排列和 eNOS 激活，以响应稳定血流。

在内皮细胞的基底表面，血流诱导细胞外基质结合整合素机械传感器的构象激活和表达变化。稳定的血流会激活整合素αvβ3，导致与细胞外基质的结合增加，下游 RHO 信号转导失活。此外，细胞质中的肌动蛋白细胞骨架已被证明用作机械感觉结构。

图3     内皮细胞中的机械传感器和机械信号转导通路。

紊乱血流诱导的内皮细胞重编程

该研究人员对 PCL 手术后同一只小鼠的 LCAs（暴露于扰动流 2 天或 2 周）和 RCAs（暴露于稳定流 2 天或 2 周）获得的单细胞进行了研究，以血流依赖性和时间依赖性方式鉴定内皮细胞和其他细胞类型的差异转录组学和表观基因组变化。scRNA-seq 和 scATAC-seq 结果独立显示，扰动流以时间依赖性方式诱导小鼠颈动脉细胞组成的动态变化。

颈动脉包含八个内皮细胞簇、四个单核细胞-巨噬细胞簇、一个 VSMC 簇、一个成纤维细胞、一个树突状细胞和一个 T 细胞，所有这些细胞在细胞身份和数量方面都以血流依赖性和时间依赖性方式变化。最有趣的是，颈动脉内皮细胞在响应血流时是异质的和动态的。在暴露于生理稳定血流条件下的 RCA 中，鉴定出四个内皮细胞亚簇（E1-E4），并随着时间的推移保持不变。然而，在暴露于促动脉粥样硬化扰动流条件的 LCA 中，大多数健康的内皮细胞亚簇（E2-E4）几乎丢失，而新的内皮细胞亚簇（E6 和 E8）出现。此外，在 RCA 内膜中发现的 VSMCs 很少，但正如预期的那样，紊乱的血流增加了 LCA 中的 VSMCs 数量。在 LCA 和 RCA 中均发现成纤维细胞，在 2 天扰动流条件下，LCA 中发现的数量最高。尽管单核细胞和巨噬细胞簇在 RCA 中很少见，但 LCA 的单核细胞和巨噬细胞数量显著增加，反映出血流紊乱时血管发生了实质性的促炎和促动脉粥样硬化改变。与巨噬细胞一样，RCA 中存在很少的树突状细胞和 T 细胞，但它们的数量因 LCA 中的扰动流而增加。

为了了解扰动流诱导内皮细胞表型变化的潜在机制，分析了 8 个不同的内皮细胞簇的差异基因表达和基因本体论。正如预期的那样，典型健康内皮细胞簇（E2）表达两个最著名的机械敏感基因 Klf2 和 Klf4 的较高水平，并且这些基因在暴露于扰动流的内皮细胞簇中表达显著降低，如 LCA 中的 E8。扰动流诱导了内皮细胞 E8 簇中基因的表达，这些基因在 VSMCs（Acta2 和 Tagln）、成纤维细胞（Dcn1）和免疫细胞（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa 和 H2-Ab1）中也高度表达，表明内皮细胞在血流紊乱条件下可能发生EndMT并获得免疫细胞样特征。通过 Panther 基因本体分析比较稳定流暴露的 E2 和扰动流暴露的 E8 簇之间的差异表达基因，发现扰动流诱导许多与促动脉粥样硬化通路相关的已知生物过程，包括炎症、EndMT、细胞凋亡、血管生成和内皮通透性。伪时间轨迹分析和其他差异基因表达和染色质可及性分析证实，E8 细胞比 E2 细胞表达更高水平的 EndMT（Acta2、Cnn1、Snai1 和 Tagln）和 EndIT（C1qa、C1qb、C5ar1 和 Tnf） 标记基因。此外，体外培养的人主动脉内皮细胞长期暴露于扰动流诱导了 EndMT 标志物（SNAI1 和 TAGLN）和 EndIT 标志物（C1QC 和 C5AR1）的表达，表明扰动流可以在没有任何其他细胞类型（如免疫细胞）的情况下诱导培养的主动脉内皮细胞重编程。这些结果表明，紊乱的血流诱导内皮细胞转变为促动脉粥样硬化表型，其特征是炎症、EndMT 和 EndIT（即 FIRE）（图4）。

图4     单细胞 RNA 测序显示受扰动流诱导的内皮细胞重编程。

总之，来自血流的剪切应力有效调节内皮细胞的表型和功能变化，从而阻止或促进动脉粥样硬化形成。内皮细胞通过介导各种机械信号转导途径的机械传感器转导这些生物力学线索，进而调节转录组和表观基因组变化以及细胞功能。高通量组学结合体内和体外实验模型的出现揭示了许多调节内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化发展的血流敏感基因、蛋白质和通路。稳定血流诱导动脉粥样硬化保护性内皮细胞表型，而血流紊乱诱导动脉粥样硬化表型，其特征是内皮形态和屏障功能改变、内皮代谢受损、氧化还原调节、增殖和细胞凋亡、炎症途径诱导以及转分化为其他细胞类型，例如 EndMT。此外，体内 scRNA-seq 和 scATAC-seq 研究表明，扰动流不仅会诱导内皮炎症和 EndMT，还会诱导 EndIT，研究人员将其定义为 FIRE（血流诱导的内皮细胞重编程）。FIRE 在内皮功能障碍和动脉粥样硬化中的机制和作用是未解之谜，调节 FIRE 的血流敏感分子可能是新的治疗靶点。

参考文献：Tamargo IA, Baek KI, Kim Y, Park C, Jo H. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023 Nov;20(11):738-753. doi: 10.1038/s41569-023-00883-1. Epub 2023 May 24. PMID: 37225873; PMCID: PMC10206587.

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