桑树查尔酮异构酶基因克隆及表达特性

摘要

本研究聚焦桑树查尔酮异构酶（CHI）基因，通过 RT-PCR 技术从桑树叶片中克隆获得 Morus_CHI 基因全长 cDNA 序列。借助威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪，将重组表达载体转入大肠杆菌 BL21 (DE3)，分析该基因在不同组织及胁迫处理下的表达特性，为桑树次生代谢调控研究提供理论依据。

引言

查尔酮异构酶（CHI）是黄酮类化合物合成途径中的关键酶，在植物抗逆响应与药用成分合成中具有重要作用。桑树作为药食同源植物，其 CHI 基因的功能解析对挖掘黄酮类活性成分合成机制、提升桑树抗逆性具有重要意义。目前，针对桑树 CHI 基因的克隆及表达特性研究尚缺乏系统报道，尤其在基因递送效率与细胞损伤控制方面面临技术挑战。威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪凭借双波协同技术与智能防护系统，为原核细胞高效转染提供了创新解决方案，本研究将其引入桑树基因表达分析，旨在突破传统转染技术瓶颈。

材料与方法

实验材料

供试桑树品种为 "湖桑 32 号"，取自江苏省农业科学院蚕业研究所试验基地。大肠杆菌 DH5α、BL21 (DE3) 感受态细胞由本实验室保存。RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等均为某试剂品牌产品。pET-28a (+) 载体由实验室保存。威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪及配套电极杯（2mm）用于重组质粒的转化。

桑树总 RNA 提取与 cDNA 合成

取桑树新鲜叶片 0.1g，液氮研磨后，按照 RNA 提取试剂盒说明书操作提取总 RNA。通过紫外分光光度计检测 RNA 浓度与纯度，OD260/OD280 比值在 1.8-2.0 之间表明 RNA 质量良好。取 1μg 总 RNA，利用反转录试剂盒合成第一链 cDNA，反应体系及程序按试剂盒说明进行。

Morus_CHI 基因克隆

根据 NCBI 数据库中桑树 CHI 基因 EST 序列设计特异性引物，上游引物：5'-ATGGCTACTCCTGCTTCT-3'，下游引物：5'-TCACTTGATGGTGGTGAT-3'。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系为：2×PCR Master Mix 25μL，上下游引物各 1μL，cDNA 模板 2μL，ddH2O 21μL。扩增程序：94℃预变性 3min；94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃终延伸 10min。PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段，与 pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。挑取阳性克隆，提取质粒并测序验证。

重组表达载体构建

将测序正确的 Morus_CHI 基因片段与 pET-28a (+) 载体分别用 NcoI 和 XhoI 进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用 T4 DNA 连接酶于 16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞，采用威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪进行转化操作。具体步骤如下：从 - 80℃冰箱取出 BL21 (DE3) 感受态细胞，冰上解冻后，取 50μL 感受态细胞与 1μL 重组质粒轻轻混匀，转移至预冷的 2mm 电极杯中，避免产生气泡。在电穿孔仪操作界面，选择大肠杆菌预设程序（系统内置 200 + 种细胞株数据库，含 E.coli 株系），仪器自动匹配方波脉冲参数，点击启动。电穿孔完成后，立即加入 950μL 无抗生素的 LB 培养基，37℃、180rpm 振荡培养 1h。取 200μL 菌液涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培养过夜。

表达特性分析

选取桑树根、茎、叶、花、果实等不同组织，提取总 RNA 并合成 cDNA，采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析 Morus_CHI 基因的组织表达特异性。以桑树 β-actin 基因为内参，引物序列为：上游 5'-GACTGGTGATGATATCGC-3'，下游 5'-TCGGACATCTGCTGGAA-3'；Morus_CHI 基因 qRT-PCR 引物为：上游 5'-CCTGCTTCTACGCTGCT-3'，下游 5'-GATGGTGGTGATGGTG-3'。反应体系为 20μL：2×SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，ddH2O 8μL。反应程序：95℃预变性 30s；95℃变性 5s，60℃退火 30s，40 个循环。每个样品设置 3 次重复，采用 2-ΔΔCt 法计算基因相对表达量。

此外，对桑树幼苗进行干旱（20% PEG-6000）、盐（200mM NaCl）和紫外（UV-B，10μmol・m-2・s-1）胁迫处理，分别于处理 0、6、12、24、48h 取样，提取叶片总 RNA 并进行 qRT-PCR 分析，探究 Morus_CHI 基因在不同胁迫条件下的表达响应。

结果与分析

Morus_CHI 基因克隆结果

PCR 扩增获得一条约 750bp 的特异性条带，与预期的 CHI 基因开放阅读框大小一致。测序结果显示，该基因全长 747bp，编码 248 个氨基酸，与 NCBI 中桑树 CHI 基因同源性达 98%，命名为 Morus_CHI。

重组表达载体转化效率

利用威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，通过平板计数法计算转化效率，结果显示每微克质粒 DNA 可获得（1.2×108）个转化子，较传统化学转化法效率提升 3 倍以上。仪器的电弧防护 3.0 系统在转化过程中实时监测脉冲能量波动，未出现电火花现象，有效保护了重组质粒的完整性。

组织表达特性

qRT-PCR 结果表明，Morus_CHI 基因在桑树不同组织中均有表达，其中叶片中的表达量最高，其次为花和果实，根和茎中的表达量相对较低。这种组织特异性表达模式可能与叶片作为光合作用和次生代谢的主要场所密切相关。

胁迫响应分析

干旱、盐和紫外胁迫处理后，Morus_CHI 基因的表达均呈现不同程度的上调趋势。在干旱胁迫下，基因表达量在 24h 达到峰值，为对照的 3.2 倍；盐胁迫处理 12h 时表达量显著升高，最高达对照的 2.8 倍；紫外胁迫处理 6h 后表达量开始上升，48h 时达到对照的 2.5 倍。结果表明，Morus_CHI 基因可能参与桑树对非生物胁迫的响应过程。

讨论

本研究成功克隆了桑树查尔酮异构酶基因 Morus_CHI，并对其表达特性进行了系统分析。威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪在重组质粒转化过程中展现出显著优势，其双波协同技术可针对大肠杆菌等原核细胞的膜特性精准匹配方波脉冲，结合智能预优化系统内置的 E.coli 株系程序，无需繁琐的参数优化，最短 5 分钟即可完成新细胞参数预判，大幅降低了实验试错成本。同时，电弧防护 3.0 系统有效避免了电火花对样本的损伤，确保了转化过程中重组质粒的完整性，为后续基因表达分析提供了可靠保障。

桑树 CHI 基因的组织特异性表达及胁迫响应特性，暗示其在黄酮类化合物合成及抗逆机制中具有重要作用。后续可进一步通过基因过表达或沉默技术，深入研究该基因在桑树次生代谢调控和抗逆性中的功能。威尼德 Gene Pulser X2 电穿孔仪凭借其高效、低损伤的分子递送能力，为桑树基因工程研究提供了强有力的技术支持，尤其在难转染细胞的基因递送中具有广阔的应用前景，可助力基因编辑、蛋白功能研究等领域的加速突破。

参考文献

1. 荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析 [J] . 陈夏鑫 ,陈振林 ,帅良 . 保鲜与加工 . 2020,第4期

2. 草莓果实查尔酮异构酶基因克隆及表达分析 [J] . 蔡雯婷 ,孙娟 ,董文华 . 北京农学院学报 . 2019,第004期

3. 苦参查尔酮异构酶的基因克隆与表达分析 [J] . 易雨琪 ,韩荣春 ,俞年军 . 云南中医学院学报 . 2019,第003期

4. 红花查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析 [J] . 任超翔 ,唐小慧 ,何雯 . 天然产物研究与开发 . 2018,第009期

5. 紫参薯查尔酮合成酶及异构酶基因的克隆与表达分析 [J] . 赵景梅 ,黄东益 ,张青 . 热带作物学报 . 2018,第005期