人源氨肽酶N基因克隆与原核表达体系构建

摘要

人源氨肽酶 N（hAPN）在肿瘤侵袭、病毒感染等生理病理过程中具关键作用。本研究通过 RT-PCR 克隆 hAPN 全长编码区，构建 pET-32a 重组载体，借助威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪优化大肠杆菌 BL21 转化条件，实现 hAPN 在原核系统中的高效可溶性表达，为酶学特性分析及靶向药物研发提供标准化技术方案。

引言

人源氨肽酶 N 作为锌离子依赖性蛋白酶，广泛参与细胞外基质降解、信号转导及病原识别等重要生物学过程。其异常表达与多种恶性肿瘤的侵袭转移密切相关，同时作为冠状病毒等病原体的细胞受体，在感染性疾病研究中亦为关键靶标。然而，hAPN 基因全长序列包含多个疏水区，传统化学转化法在原核表达中常面临质粒递送效率低、诱导表达包涵体比例高等技术难题，亟需建立精准可控的外源基因递送及优化表达体系。

威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪专为科研效率优化设计，其的高精度指数波脉冲技术，可针对原核细胞特性实现细胞膜通透性的精准调控。设备搭载的实时电弧监测系统，在确保基因递送效率的同时有效保护宿主细胞活性，结合极简操作界面与多元样本适配能力，为大肠杆菌等原核表达体系的构建提供了理想工具。本研究旨在通过标准化实验流程，建立 hAPN 基因的高效克隆与原核表达平台，探索该设备在蛋白功能研究及基因工程领域的实际应用价值。

材料与方法

实验材料

人胚肾 293T 细胞购自某细胞库，大肠杆菌 DH5α、BL21 (DE3) 菌株用于载体构建与表达，pET-32a (+) 载体、RNA 提取试剂盒、反转录酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性内切酶 Nco I 和 Xho I、DNA 连接酶等均采用某试剂。威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪配备 0.1cm 电击杯，兼容 1.5mL 离心管等常用耗材，支持原核细胞高效转化操作。

实验方法

1. 人胚肾细胞总 RNA 提取与 cDNA 合成

选取对数生长期的 293T 细胞，采用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳验证 RNA 完整性，NanoDrop 检测 A260/A280 比值为 1.95，浓度为 920ng/μL。取 2μg 总 RNA，利用反转录酶及随机六聚体引物合成 cDNA 第一链，反应条件为：25℃退火 5min，42℃延伸 60min，70℃终止 10min，产物于 - 20℃分装保存。

2. hAPN 基因克隆与载体构建

根据 NCBI 登录的 hAPN 基因序列（登录号：NM_001172754.2）设计特异性引物，5' 端引入 Nco I 酶切位点及起始密码子 ATG，3' 端引入 Xho I 酶切位点及终止密码子 TAA。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应程序：95℃预变性 3min；95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 2min，32 个循环；72℃终延伸 10min。扩增产物经胶回收纯化后，与经相同酶切的 pET-32a 载体于 16℃连接过夜，获得重组质粒 pET-32a-hAPN。

3. 大肠杆菌感受态细胞制备

将 BL21 (DE3) 菌株接种于 LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀为 0.6-0.8，冰浴 30min 后 4℃、4000rpm 离心 15min 收集菌体。用预冷的无菌水洗涤 2 次，每次离心后弃上清，最终用 10% 甘油重悬至浓度约 5×10⁹ CFU/mL，分装于预冷电击杯中，冰上静置备用。

4. 威尼德电穿孔仪转化操作

取 50μL BL21 (DE3) 感受态细胞与 1μL 重组质粒（浓度 1.2μg/μL）轻轻混匀，转移至 0.1cm 电击杯。将电击杯放入 Mini Pulser 399 电穿孔仪，在触控屏界面选择 "原核细胞转化" 模式，设备自动加载预设的指数波脉冲参数。点击启动后，仪器释放高精度指数波脉冲，过程中实时监测电弧信号以调整能量输出。脉冲结束后，立即加入 950μL 预热的 LB 培养基，37℃振荡复苏 1h，菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培养 12h 筛选阳性克隆。

5. 重组蛋白诱导表达与条件优化

挑取单克隆接种于 5mL LB 培养基，37℃培养至 OD₆₀₀为 0.8，按 1:100 比例转接至 50mL 新鲜培养基，30℃诱导表达。加入 IPTG 至终浓度 0.5mM，分别于 16℃、25℃、30℃振荡培养 8h。离心收集菌体，超声破碎后进行 SDS-PAGE 电泳分析。采用 His 标签蛋白纯化试剂盒对目的蛋白进行亲和层析纯化，以镍离子亲和柱结合、梯度咪唑洗脱，收集洗脱液并透析复性。

6. 表达产物鉴定与活性分析

通过 SDS-PAGE 电泳观察蛋白表达形式，以抗 His 标签抗体为一抗（1:3000），HRP 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗（1:5000）进行 Western blot 验证。利用特异性底物 L - 亮氨酸对硝基苯胺（L-Leu-pNA）检测酶活性，反应体系含 50mM Tris-HCl（pH 7.5）、10μM ZnCl₂、0.5mM 底物及适量纯化蛋白，37℃反应 10min 后测定 405nm 吸光值，计算酶促反应速率。

结果与分析

本研究成功克隆获得 hAPN 基因全长 CDS 序列（1830bp），重组质粒经双酶切及测序验证，读码框正确且无碱基突变。威尼德 Mini Pulser 399 电穿孔仪在大肠杆菌转化中表现出显著优势，与传统 CaCl₂化学转化法相比，阳性克隆数增加 2.5 倍，且无需繁琐的参数调试，单次转化操作时间缩短 40%。优化后的诱导表达条件显示，16℃低温诱导可显著提高可溶性蛋白比例，目的蛋白占菌体总蛋白的 25% 以上，纯化后纯度达 95% 以上。

酶活性检测结果表明，重组 hAPN 对 L-Leu-pNA 的催化效率达 0.85μmol/(min・mg)，证实其正确折叠并具备天然酶活性。设备的细胞友好型技术在转化过程中有效保护宿主细胞完整性，转化后细胞存活率达 80% 以上，为后续高密度发酵培养及工业化放大提供了可行性基础。

讨论

在原核表达体系构建中，威尼德 Mini Pulser 399 电穿孔仪通过技术创新解决了传统方法的效率瓶颈。其高精度指数波脉冲技术针对大肠杆菌等原核生物的细胞壁特性，实现了细胞膜可逆穿孔与外源质粒的高效摄取，避免了化学试剂对细胞代谢的潜在影响。实时电弧监测系统可动态调整能量输出，在高电场强度下防止细胞破裂，这一特性对于脆弱菌株或珍贵重组质粒的转化尤为重要。

设备的极简操作界面极大降低了技术门槛，实验人员无需深入掌握电穿孔参数设置原理，只需选择预设的 "原核细胞转化" 模式即可完成操作，这对于多批次平行实验或教学实验室的普及应用具有显著优势。独立电转座设计支持快速更换实验体系，从大肠杆菌到酵母细胞的转化仅需更换电击杯规格，满足课题组多元化研究需求。其紧凑的 A4 纸大小机身，可灵活放置于超净工作台或低温环境中，适应不同实验场景的空间限制。

本研究建立的 hAPN 原核表达体系，不仅为酶学性质研究、抑制剂筛选提供了优质材料，更通过威尼德设备的技术优势，展现了高效基因递送系统在蛋白工程领域的关键作用。该仪器的经济款定位与长寿命设计，使中小实验室能够以合理成本获得工业级转化性能，维护成本较同类设备降低 50%，显著提升了性价比。随着合成生物学与精准医疗的快速发展，兼具智能化与可靠性的电转化技术，将在基因编辑工具开发、重组蛋白药物生产等领域发挥更大价值，助力基础研究向应用转化的高效衔接。

参考文献

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