马铃薯WRKY6基因克隆与表达

摘要

本研究聚焦马铃薯抗逆相关 WRKY6 基因，通过 RT-PCR 技术克隆目的基因，构建 pET-28a 重组表达载体，借助威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪优化农杆菌 GV3101 转化体系，实现 WRKY6 蛋白在拟南芥原生质体中的高效瞬时表达，为解析马铃薯逆境响应分子机制及抗逆品种改良提供关键靶标与技术支撑。

引言

马铃薯作为全球重要的粮菜兼用作物，其产量与品质受干旱、盐渍等逆境胁迫影响显著。WRKY 转录因子家族在植物抗逆信号通路中扮演核心调控角色，其中 WRKY6 基因被证实参与脱落酸介导的胁迫响应网络，但马铃薯 WRKY6 基因的功能解析及高效表达体系构建仍存在技术瓶颈。传统基因转化方法在原生质体等难转染细胞中效率低下，且脉冲参数调试依赖经验摸索，易导致细胞损伤与目的基因递送失败。

威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪作为革新性分子递送平台，突破传统转染技术桎梏，以双波协同技术与智能防护系统为核心，可针对原核、真核及难转染细胞提供精准电转化方案。其内置 200 + 种细胞株预优化程序，结合方波与指数波智能切换功能，在保持细胞高存活率的同时显著提升基因递送效率，为马铃薯基因功能研究与抗逆分子育种提供了理想工具。本研究旨在建立马铃薯 WRKY6 基因的高效克隆与表达体系，探索该仪器在植物基因工程领域的实际应用价值。

材料与方法

实验材料

马铃薯栽培品种 "陇薯 7 号" 块茎由本实验室保存，大肠杆菌 DH5α、农杆菌 GV3101 用于载体构建与转化，拟南芥 Col-0 生态型原生质体通过酶解法制备。pET-28a (+) 载体、RNA 提取试剂盒、反转录酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性内切酶 BamH I 和 Sal I、DNA 连接酶等均采用某试剂。威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪配备 0.2cm 电击杯，兼容 96 孔板等多规格耗材，用于重组质粒转化操作。

实验方法

1. 马铃薯总 RNA 提取与 cDNA 合成

选取逆境处理 48h 的马铃薯叶片，液氮研磨后采用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，NanoDrop 测定 A260/A280 比值为 1.98，浓度为 850ng/μL。取 1μg 总 RNA，利用反转录酶及 Oligo (dT) 引物合成 cDNA 第一链，反应条件为：25℃退火 10min，42℃延伸 50min，70℃终止 15min，产物于 - 80℃分装保存。

2. WRKY6 基因克隆与载体构建

根据 NCBI 登录的马铃薯 WRKY6 基因序列（登录号：XM_006356212.3）设计特异性引物，引入 BamH I 和 Sal I 酶切位点。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应程序：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃终延伸 10min。扩增产物经胶回收纯化后，与经相同酶切的 pET-28a 载体于 16℃连接过夜，获得重组质粒 pET-28a-WRKY6。

3. 感受态细胞制备与电转化前处理

将农杆菌 GV3101 接种于 YEP 培养基，28℃振荡培养至 OD₆₀₀为 0.5-0.7，冰浴 30min 后 4℃、5000rpm 离心 15min 收集菌体。用预冷的无菌水洗涤 3 次，每次离心后弃上清，最终用 10% 甘油重悬至浓度约 1×10¹⁰ CFU/mL，分装于预冷电击杯中，冰上静置 10min。

4. 威尼德电穿孔仪转化操作

取 50μL 农杆菌感受态细胞与 2μL 重组质粒（浓度 1.5μg/μL）轻轻混匀，转移至 0.2cm 电击杯。将电击杯放入 Gene Pulser X2 电穿孔仪，在触控屏界面选择 "植物病原细菌" 预优化程序，该程序通过智能阻抗检测自动匹配脉冲参数，无需人工调试。点击启动后，仪器交替释放方波与指数波脉冲，10 英寸屏幕实时显示波形动态及电压、脉冲次数等参数。脉冲结束后，立即加入 950μL 预热的 YEP 培养基，28℃振荡复苏 2h，菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 YEP 平板，28℃培养 48h 筛选阳性克隆。

5. 原生质体分离与瞬时表达诱导

采用酶解液（2% 纤维素酶 R-10，0.5% 离析酶 R-10，0.4M 甘露醇）消化拟南芥叶片，经 200 目滤网过滤后，100g 离心 5min 收集原生质体。将 1×10⁶个原生质体与 10μg 重组质粒混合，加入 PEG4000 转化液室温孵育 15min，同步使用 Gene Pulser X2 的 "植物原生质体" 专用程序进行电转化。转化后细胞在 W5 培养基中 25℃避光培养 24h，收集细胞进行蛋白提取。

6. 重组蛋白表达检测与优化

通过 SDS-PAGE 电泳分析蛋白表达，以 His 标签抗体为一抗（1:5000），HRP 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗（1:10000）进行 Western blot 验证。设置不同脉冲波形（方波 / 指数波）、电压梯度（200-300V）及脉冲次数（1-3 次）组合，经灰度分析确定转化条件为：方波模式，250V 电压，2 次脉冲，此时目的蛋白表达量较传统方法提升 40%，细胞存活率达 85% 以上。

结果与分析

本研究成功克隆获得马铃薯 WRKY6 基因全长 CDS 序列（1125bp），重组质粒经双酶切及测序验证，读码框正确且无碱基突变。威尼德 Gene Pulser X2 电穿孔仪在农杆菌转化中展现出显著优势，与传统化学转化法相比，阳性克隆数增加 3 倍，且脉冲参数的智能匹配避免了细胞过度损伤。在拟南芥原生质体瞬时表达体系中，双波协同技术针对植物细胞膜特性优化递送效率，使 WRKY6 蛋白在 24h 内实现高效表达，为后续亚细胞定位及转录激活活性分析提供了优质材料。

讨论

在植物基因工程研究中，威尼德 Gene Pulser X2 双波全能型电穿孔仪通过技术创新突破了传统转化的效率与适用性瓶颈。其双波协同技术可根据细胞类型智能切换方波与指数波：方波适用于细菌、真菌等原核细胞的高强度脉冲穿孔，指数波则针对植物原生质体、哺乳动物细胞等真核细胞实现温和高效递送，避免了单一波形在跨物种应用中的局限性。电弧防护 3.0 系统通过实时能量监测，有效保护马铃薯 RNA、质粒等珍贵生物样本，尤其适合逆境胁迫下微量样品的转化需求。

本研究建立的马铃薯 WRKY6 基因表达体系，不仅为解析其在干旱、盐胁迫响应中的分子机制奠定了基础，更通过威尼德电穿孔仪的技术优势，展现了先进设备在植物抗逆基因挖掘与应用中的关键作用。该仪器开放的 API 接口与自动化工作站兼容性，为未来构建高通量基因编辑筛选平台提供了拓展空间，尤其适用于马铃薯等多倍体作物的复杂基因组操作。随着农业生物技术向精准化、高效化方向发展，兼具智能化与高可靠性的电转化技术，将在作物抗逆育种、次生代谢产物合成等领域发挥更大价值，助力解决全球粮食安全面临的逆境胁迫挑战。

参考文献

1.  Ishiguro S, Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato[J]. Molecular and General Genetics, 1994, 244(6): 563-571.

2.  Robatzek S, Somssich I E. A new member of the Arabidopsis WRKY transcription factor family, AtWRKY6, is associated with both senescence-and defence-related processes[J]. Plant Journal, 2001, 28: 123-133.

3.  Lagacé M, Matton D P. Characterization of a WRKY transcription factor expressed in late torpedo stage embryos of Solanum chacoense[J]. Planta, 2004, 219: 185-189.

4.  Xu Y H, Wang J W, Wang S, et al. Characterization of GaWRKY1, a cotton transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene (+)-δ-cadinene synthase-A[J]. Plant Physiology, 2004, 135: 507-515.

5.  Zhang Z L, Xie Z, Zou X L, et al. A rice WRKY gene encodes a transcriptional repressor of the gibberellin signaling pathway in aleurone cells[J]. Plant Physiology, 2004, 134: 1500-1513.

6.  Chen C, Chen Z. Isolation and characterization of two pathogen and salicylic acid-induced genes encoding WRKY DNA-binding proteins from tobacco[J]. Plant Molecular Biology, 2000, 42: 387-396.

7.  Sun C X, Palmqvist S, Olsson H, et al. A novel WRKY transcription factor, SUSIBA2, participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of theiso1 promoter[J]. Plant Cell, 2003, 15: 2076-2092.

8.  Hwang E W, Kim K A, Park S C, et al. Expression profiles of hot pepper (Capsicum annum) genes under cold stress conditions[J]. Journal of Biosciences, 2005, 30(5): 657-667.

9.  Wei W, Zhang Y X, Han L, et al. A novel WRKY transcriptional factor from thlaspi caerulescens negatively regulates the osmotic stress tolerance of transgenic Tobacco[J]. Plant Cell Reports, 2008, 27(4): 795-803.

10.  Wang J, Zhang S, Stacey G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin[J]. Molecular Plant Pathology, 2004, 5: 125-135.