多柱筛选助力合成肽高效分离

合成肽的生产涉及多个步骤，包括脱保护、活化、偶联和从固相支持体上切割最终序列。杂质，例如因过早链终止或缺失氨基酸产生的杂质，会影响最终产品的安全性和有效性，因此，必须通过液相色谱分析分离这些杂质。在液相分析中，选择合适的流动相和色谱柱对于各组分实现最佳分离至关重要。

采用岛津LCMS-2050单杆质谱仪，进行多种流动相、多柱的筛选，搭配LabSolutions MD软件，有效提升合成肽相关杂质方法开发的效率。

此次研究基于一种肽和五种具有不同序列的有关杂质作为合成肽的模型样品(表1)。制备全长肽(FLP:B-促黑素)、较短长度产物的 p.A1del、p.A1_E2del、p.A1_K3del 和 p.A1、D5del的缺失序列以及 Met(O2)(FLP 中的甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸砜)作为样品。

色谱柱

Shim-pack Scepter C18-120

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GISS C18

(1.9μm,3.0x100mm）

Shim-pack Velox SP-C18

(1.8μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter C8

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter Phenyl

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GIST HP C18-AQ

(1.9μm,3.0x100mm)

柱温：40℃

样品溶剂：水

流动相：

A：

Line A：0.1%三fu乙酸水溶液

Line B：0.1%甲酸水溶液

Line C：10mmol/L甲酸铵（pH=4）水溶液

Line D：10mmol/L乙酸铵（pH=5）水溶液

B：

Line A：乙腈

Line B：甲醇

流速：0.5mL/min

洗脱梯度：10%B（0min）→60%B（10 min）→10%B(10.01min-15min）

紫外检测器：220 nm

质谱系统：LCMS-2050

对比流动相和色谱柱的筛选结果，水相流动相和有机相流动相的组成对 FLP 及相关杂质的分离有显著影响。基于LabSolutions MD软件计算评估值，如表2所示。从中选择的分析条件进行进一步方法优化。

进一步优化柱温，考察筛选出评估值最高的3个检测条件下，柱温对于分离的影响。使用 Scepter C8-120 色谱柱，采用 0.1%甲酸和甲醇的流动相，p.A1del和 FLP 之间的分离度更好。

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(0.1%甲酸/甲醇/ScepterC8-120)

80℃(① ),70℃(②),60℃(③),50℃℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸铵 /乙腈:甲醇=50:50 /Velox SP-C18)

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸铵 /甲醇/Scepter C8-120)