脂质纳米颗粒（LNPs）在保护mRNA并促进其进入靶细胞进行蛋白质合成方面表现出色。然而，细胞摄取LNPs后，mRNA的翻译效率不仅取决于LNPs的递送效率，还受到细胞内必需代谢物（如代谢能量源、辅酶和氨基酸）可用性的影响。本研究提出了一种代谢物共递送策略，通过将关键代谢物封装在mRNA LNPs中，以提高mRNA的翻译效率。实验结果表明，与不含代谢物的LNPs相比，共递送ATP和GTP的LNPs在体外和体内均显著提高了mRNA编码蛋白的表达水平，尤其在缺氧条件下效果更为显著。这一策略为改善mRNA LNP疗法提供了新的思路。
结果与讨论
本研究选择了四类关键代谢物进行共递送，包括核苷酸/核苷酸衍生物（ATP、GTP、ADP、AMP、焦磷酸）、氨基酸（L-His）、辅酶（NAD、FAD、NADH）和碳水化合物（葡萄糖）。通过微流体混合技术制备了包含这些代谢物的LNPs，并对其进行了表征。结果显示，LNPs的粒径在157-187 nm之间，多分散性指数（PDI）在0.14-0.26之间，表面电荷（ζ电位）在-3.5-1.5 mV之间，这些参数与不含代谢物的LNPs相似，表明代谢物的加入并未显著影响LNPs的物理性质。此外，mRNA的封装效率在63.0-90.0%之间，各代谢物的封装效率在5.0-68.9%之间，表明代谢物被成功封装在LNPs中。萤火虫荧光素酶（FLuc）表达：在常氧（21%氧气）和缺氧（1%氧气）条件下，评估了不同代谢物共递送的LNPs对FLuc表达的影响。实验结果显示，在常氧条件下，共递送GTP和ATP的LNPs显著提高了FLuc的表达水平，分别比不含代谢物的LNPs提高了约9倍和8倍（图2b）。相比之下，共递送氨基酸、辅酶和碳水化合物的LNPs对FLuc表达水平的提升不显著（图2b）。在缺氧条件下，共递送GTP和ATP的LNPs仍然显著提高了FLuc的表达水平，分别比不含代谢物的LNPs提高了约19倍和16倍（图2c）。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达：通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，发现共递送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧条件下均显著提高了EGFP的表达水平。在常氧条件下，与不含代谢物的LNPs相比，共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞显示出更强的绿色荧光信号（图2d）。在缺氧条件下，这一趋势同样明显（图2e）。人促红细胞生成素（EPO）表达：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估，发现共递送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧条件下均显著提高了EPO的表达水平。在常氧条件下，与不含代谢物的LNPs相比，共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞上清液中EPO的浓度分别提高了约3倍和2.5倍（图2f）。在缺氧条件下，这一提升效果更为显著，共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞上清液中EPO的浓度分别提高了约4倍和3.5倍（图2g）。
1.3 机制研究结果：
细胞黏附与摄取：通过流式细胞仪和共聚焦显微镜观察，发现共递送GTP和ATP的LNPs显著增加了细胞黏附与摄取。与不含代谢物的LNPs相比，共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞显示出更高的几何平均荧光强度（GMFI），表明更多的LNPs被细胞摄取（图3a, b）。共聚焦显微镜观察结果进一步证实了这一点，共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞内红色荧光信号（代表Cy5标记的FLuc mRNA）更强（图3c, d）。内吞机制：通过使用特定的内吞抑制剂（EIPA、NaN₃和细胞松弛素D），探究了不同LNPs的内吞途径。实验结果显示，共递送GTP和ATP的LNPs主要通过能量依赖的内吞途径被细胞摄取（图3e-g）。这一发现为理解我们的代谢物共递送策略如何影响LNPs的细胞摄取提供了重要线索。内涵体逃逸：通过共聚焦显微镜和Pearson相关系数（PCC）分析，评估了不同LNPs的内涵体逃逸特性。实验结果显示，共递送GTP和ATP的LNPs在内涵体逃逸方面表现出更好的特性，PCC值显著低于不含代谢物的LNPs（图4c）。此外，通过钙黄绿素泄漏实验，发现共递送GTP和ATP的LNPs处理后的细胞中钙黄绿素信号更广泛地分布于细胞质中，进一步证实了其更好的内涵体逃逸特性（图4d）。
1.4 体内疗效与耐受性评估结果：
体内FLuc表达：在雌性C57BL/6小鼠中通过尾静脉注射评估不同LNPs的体内疗效。实验结果显示，共递送GTP和ATP的LNPs显著提高了FLuc在肝脏和脾脏中的表达水平（图5a, b）。特别是ATP共递送的LNPs，其FLuc信号强度显著高于不含代谢物的LNPs（图5b）。此外，代谢物共递送策略并未改变LNPs的天然生物分布特性（图5c）。体内EPO表达：通过ELISA评估血清中EPO的浓度，发现共递送GTP、ATP和AMP的LNPs显著提高了EPO的表达水平（图5d）。这一结果表明，代谢物共递送策略在体内同样能够有效提高mRNA编码蛋白的表达水平。耐受性评估：通过组织学评估、血液检测和体重保留研究，发现代谢物共递送策略在体内表现出良好的耐受性。组织学评估结果显示，共递送代谢物的LNPs处理后的小鼠主要器官（肝脏、脾脏和肺）未出现明显的组织损伤或炎症反应（图5e）。血液检测结果显示，共递送代谢物的LNPs处理后的小鼠血液生化指标（如碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、血尿素氮和肌酐）与PBS对照组无显著差异（图5f）。此外，体重保留研究结果显示，共递送代谢物的LNPs处理后的小鼠体重与PBS对照组无显著差异（图S9）。这些结果表明，代谢物共递送策略在体内是安全且可耐受的。结论
本研究提出了一种代谢物共递送策略，通过将关键代谢物封装在mRNA LNPs中，显著提高了mRNA的翻译效率。共递送ATP和GTP的LNPs在体外和体内均表现出优异的疗效，尤其在缺氧条件下效果更为显著。此外，这些LNPs还显示出良好的耐受性。未来研究将进一步探讨ATP和GTP如何改善LNP的递送效率，并评估该策略在其他疾病模型中的应用潜力。
参考文献：Ma, Yutian, et al. "A Metabolite Co-Delivery Strategy to Improve mRNA Lipid Nanoparticle Delivery." ACS Applied Materials & Interfaces (2025).
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