脂质辅料新研究-新型辅助磷脂（DOPE-X）显著提高mRNA-LNP的体内递送

材料与方法

1.1 材料：

• LNPs的制备：采用微流控混合技术，将含有CL4F6、磷脂、胆固醇和PEG-DMG的乙醇溶液与含有mRNA的醋酸盐缓冲液混合，制备LNPs。通过透析和超滤步骤纯化LNPs。
• LNPs的表征：使用动态光散射（DLS）测量LNPs的粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位。通过核磁共振磷谱（31P NMR）和小角X射线散射（SAXS）分析脂质相行为。
• 体内实验：采用BALB/c小鼠模型，通过尾静脉注射LNPs，评估mRNA在肝脏中的表达水平。使用生物发光成像系统（IVIS）监测LNPs在体内的分布。

结果与讨论

• DSPC与DOPE对照组：与含有DSPC的LNPs相比，含有DOPE的LNPs并未显著提高mRNA的表达水平，这表明单纯替换DSPC为DOPE并不能有效改善mRNA的递送效率。
• DOPE-Cx变体：引人注目的是，含有DOPE-Cx变体（特别是DOPE-C6、C8和C10）的LNPs显著提高了mRNA在肝脏中的表达水平。其中，DOPE-C8表现出最高的mRNA表达水平，相较于DSPC对照组，其Fluc活性提高了数倍。
• 链长依赖性：进一步的研究发现，DOPE-Cx磷脂的疏水链长度对mRNA表达水平有显著影响。较短的疏水链（如C4和C6）和较长的疏水链（如C12和C18:1）均未能达到与DOPE-C8相当的表达水平，表明存在一个最佳的疏水链长度范围。

³¹P NMR分析：为了深入理解DOPE-Cx磷脂如何影响LNPs的脂质相行为，我们采用了31P核磁共振（NMR）技术。将DOPE-Cx磷脂与磷脂酰胆碱（POPC）以不同摩尔比混合，并制备成脂质悬浮液进行NMR分析。

• 层状相与非层状相：纯DOPE在与POPC混合时，迅速从六方相（H相）转变为层状相（L相）。然而，DOPE-Cx磷脂在与POPC混合时，能够诱导形成非层状立方相（Q相），这在NMR谱图中表现为在0 ppm处出现尖锐的峰。

• 链长与相行为：进一步的分析表明，DOPE-Cx磷脂的疏水链长度对其诱导立方相的能力有显著影响。较短的疏水链（如C4至C8）更有利于立方相的形成，而较长的疏水链则倾向于形成六方相。

SAXS与Cryo-TEM验证：为了进一步验证DOPE-Cx磷脂诱导立方相的形成，我们采用了小角X射线散射（SAXS）和冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）技术。

• SAXS分析：SAXS谱图显示，含有DOPE-C8和POPC的脂质悬浮液在低角度区域出现了特征性的立方相散射峰，进一步证实了立方相的存在。

• Cryo-TEM观察：Cryo-TEM图像清晰地展示了含有DOPE-C8和POPC的脂质纳米颗粒内部存在有序的立方相结构，这与NMR和SAXS的分析结果一致。

结论

参考文献：Iwakawa, Kazuki, et al. "Cubic Phase‐Inducible Zwitterionic Phospholipids Improve the Functional Delivery of mRNA." Advanced Science (2025): 2413016.