微生物发酵研究新方案：自动化与高通量的结合

在微生物发酵研究领域，如何快速、高效地获取微生物在不同条件下的基因表达信息，一直是科研人员关注的重点。今天要给大家介绍一项刊登于Microorganisms的研究，它通过自动化液体工作站，将RNA-Seq样本制备与微型平行生物反应器相结合，实现了高通量的差异基因表达研究，为生物过程开发带来了新的思路和方法。

研究背景

生物过程开发中，确定生产菌株的最佳培养条件十分关键。平行生物反应器系统结合自动化和微型化方法，能加速这一进程。而RNA-Seq技术可从分子层面了解微生物生产菌株，但此前自动化、高通量的批量RNA-Seq设置尚未见报道。本研究旨在填补这一空白，利用酿酒酵母，在微型平行搅拌罐生物反应器中，结合自动化RNA-Seq样本制备流程，研究不同碳源对其基因表达的影响。

实验方法

1. 实验菌株和培养基：使用野生型酿酒酵母菌株（DSM No. 1333），菌种培养基于YPD培养基，平行搅拌罐生物反应器培养使用特定成分的培养基，添加抗生素防止污染。

2. 平行搅拌罐生物反应器：采用24搅拌罐生物反应器单元，工作体积11mL，集成到液体处理系统中，该系统配备多种功能模块，可实现自动化操作。温度、pH、溶解氧等参数精准控制，还能定期采样进行光密度（OD600）测量。

3. 自动化RNA-Seq样本制备流程：基于液体处理站（LHS）开发并优化了24个反应器的自动化RNA-Seq样本制备流程。当葡萄糖培养的搅拌罐反应器平均OD600超过2.5时，触发样本制备流程。流程包括酶解细胞裂解、总RNA提取、核酸浓度归一化和cDNA文库制备，且与发酵过程并行进行。其中，RNA提取使用特定试剂盒，cDNA文库制备自动化完成，不过样本收集、移液器吸头补充以及最终的文库定量和上样等步骤需手动操作。

4. RNA-Seq数据分析：测序数据经一系列软件处理，包括碱基识别、读长筛选、与参考转录组比对等。通过tximport汇总蛋白编码转录本，使用edgeR进行差异基因表达分析，以特定阈值筛选差异表达基因，最后用clusterProfiler进行基因集富集分析。

实验优势：自动化液体工作站的关键作用

1. 高通量与高效性：自动化液体工作站能同时操作24个平行生物反应器，11.5小时内完成24个样本的RNA提取和cDNA文库制备，大大提高了实验通量，相比传统方法节省大量时间。让科研人员能够在更短的时间内获取大量宝贵数据。

2. 精准操作与稳定运行：液体工作站配备多种功能模块，可精准控制实验条件，Hamilton配置的生物反应器可以精准设置控制如温度、搅拌速度、pH等实验条件。在样本制备过程中，对不同体积试剂的移液操作也能保证较高的准确性和精度，减少实验误差。

3. 实现流程整合：它将发酵过程与RNA-Seq样本制备流程整合在同一平台，避免了样本转移带来的误差和污染风险，还能及时处理RNA样本，减少细胞过程变化对实验结果的影响。一个功能完备的实验系统。工作站上配备的多种功能模块，从试剂添加、样本混合到反应条件控制，都能一站式完成。这种高度集成化的设计，不仅节省了实验空间，还大大提高了实验操作的便捷性和连贯性，让科研人员能够更专注于实验核心环节。这也归功于BioReactor生物反应器的小巧以及工作站可整合性。

实验结果

1. 不同碳源下的生长情况：酿酒酵母在不同碳源下生长模式各异。葡萄糖、果糖和蔗糖为碳源时，前期呈指数增长，耗尽后利用乙醇继续生长；半乳糖和甘露糖为碳源时，延迟期长且生长缓慢；丙酮酸为碳源时，生长受限。

2. RNA和cDNA浓度：RNA提取后，不同样本RNA产量有差异，丙酮酸培养的样本RNA产量显著较低，葡萄糖培养的样本RNA产量较高。cDNA产量在不同生物重复间差异较大，主要受低体积试剂移液准确性影响。

3. 测序结果与差异基因表达分析：测序得到大量高质量读长，经筛选和比对，确定了不同条件下的差异表达基因。如葡萄糖与丙酮酸比较，有大量差异表达基因，涉及多种代谢途径；葡萄糖与果糖比较，差异表达基因较少，这与预期细胞反应相符。

研究展望

本研究建立的高通量实验方法为生物反应器培养的分子水平评估提供了有效手段，但仍有改进空间。后续可进一步优化液体类开发，采用例如Hamilton Magpip移液通道，提高通量减少试剂耗材成本；还可拓展该方法，使其适用于更多微生物，推动生物过程开发的发展。

这项研究借助自动化液体工作站，为微生物发酵研究带来了新突破。相信在未来，随着技术的不断优化和完善，它将在生物工程领域发挥更大的作用，助力科研人员探索更多生命奥秘。

关于Hamilton生物反应器

Bioreactor是基于Hamilton STAR液体处理平台与2mag合作设计开发的生物反应器。在一个非常紧凑的空间里，多达48个生物反应器可并行运行，并根据需要进行自动进料、pH调节、诱导和采样。与STAR液体处理工作站无缝集成，高氧气传输率和功率输入可与实验室规模的生物反应器相媲美。

参考文献

[1] Blums, K., Herzog, J., Costa, J., Quirico, L., Turber, J., & Weuster-Botz, D. (2025). Automation of RNA-Seq Sample Preparation and Miniaturized Parallel Bioreactors Enable High-Throughput Differential Gene Expression Studies. Microorganisms,13(4),849.