高效检测激酶活性：Revvity HTRF® KinEASE试剂盒

在药物研发和生命科学研究中，蛋白激酶作为细胞信号转导的核心调控元件，在多种病理生理过程中扮演关键角色。据统计，人类基因组编码的518种蛋白激酶中，约有30%与肿瘤、自身免疫病和代谢性疾病的发生发展密切相关。目前，全球激酶抑制剂市场规模已突破750亿美元，并保持10%以上的年增长率，成为肿瘤和自身免疫疾病治疗的核心领域。

激酶异常活化的病理机制

01信号转导失调

正常生理状态下，激酶通过精确的磷酸化调控维持细胞功能平衡。而在疾病状态下，激酶活性异常（过度活化或抑制不足）会导致下游信号通路紊乱，驱动细胞增殖、炎症反应或代谢异常等病理过程。

02多通路交叉调控

激酶网络具有高度的复杂性和冗余性，常形成正反馈循环和代偿机制。例如：

• MAPK通路异常与肿瘤发生发展

• JAK-STAT通路过度活化与自身免疫病

• PI3K-AKT-mTOR通路失调与代谢性疾病

典型激酶相关疾病及治疗靶点

Revvity激酶研究解决方案

传统激酶活性检测方法（放射性检测、ELISA等）存在操作繁琐、通量受限等问题，而ADP-Glo方法需要自行寻找活性底物，且是间接检测酶活。Revvity基于HTRF/LANCE均相检测平台，提供激酶研究解决方案，可为研究者提供高效、快速的激酶抑制剂筛选方法。

01Kinase活性检测试剂盒

适用于功能性激酶抑制的筛选，通过直接检测底物磷酸化水平的变化，定量分析化合物对激酶催化活性的抑制能力。

02Kinase结合检测试剂盒

适用于激酶结合剂的筛选，通过竞争性结合实验检测化合物与激酶活性位点或变构位点的亲和力。

Kinase检测技术具有以下优势：

• 高灵敏度：可检测pM级激酶活性变化

• 生理相关性：保持天然构象的激酶-底物相互作用

• 高通量：适合大规模化合物筛选，检测仅需2小时

• 高兼容性：试剂盒配备的通用型底物兼容200+激酶

HTRF技术原理与应用实例

KinEASE活性检测试剂盒

检测原理

KinEASE激酶活性检测试剂盒基于均相时间分辨荧光共振能量转移(HTRF)技术，采用通用型生物素化丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）或者酪氨酸（TK）底物与链霉亲和素-XL665（SA-XL665）受体结合，当激酶催化底物磷酸化后，供体铕穴状化合物（Eu³⁺-cryptate）标记的磷酸化特异性抗体可识别并结合磷酸化位点，形成"供体-底物-受体"三元复合物；在320/340nm激发光作用下，供体产生的620nm发射光通过能量转移激发受体发出665nm特征信号，该信号由酶标仪检测并定量分析激酶活性。

图1. HTRF KinEASE活性检测原理

操作流程

步骤1：反应启动

将待测化合物（或对照缓冲液）与激酶、底物混合，加入ATP启动磷酸化反应。

步骤2：检测体系构建

反应孵育适当时间后，加入铕（Eu）标记的磷酸化抗体及SA-XL665受体，形成检测复合物。

步骤3：信号检测

继续孵育1小时后，使用酶标仪读取信号（激发波长320/340 nm，检测发射波长620 nm和665 nm）。

图2. HTRF KinEASE 活性检测步骤

验证数据

HTRF KinEASE试剂盒已完成200余种丝氨酸/苏氨酸激酶及酪氨酸激酶的活性检测验证。同时，我们也提供LANCE® Ultra激酶检测平台作为选择

酶浓度梯度滴定曲线与时间动力学特征

广谱抑制剂星形孢菌素（Staurosporine）剂量依赖性抑制效应

激酶结合检测试剂盒

检测原理

Revvity KinEASE结合检测试剂盒采用HTRF竞争法检测原理，通过Eu³⁺-cryptate标记的GST/6His/生物素抗体捕获相应标记的激酶，当激酶与荧光标记的ATP竞争性抑制剂示踪剂（Staurosporine、Dasatinib或Sunitinib）结合时，HTRF信号比（665nm/620nm）随示踪剂结合增加而升高；待测化合物通过竞争性结合激酶ATP位点取代荧光示踪剂，导致FRET信号减弱，从而实现对激酶抑制剂的快速筛选和亲和力评估。

图3. HTRF Kinase Binding检测原理

操作流程

步骤1：复合物形成

将Eu³⁺-cryptate标记的抗体（抗GST/6His/生物素）与标签激酶孵育，使其特异性结合；同时加入荧光示踪剂（Staurosporine/Dasatinib/Sunitinib-XL665）和待测化合物，两者竞争性结合激酶的结合位点

步骤2：信号检测

继续孵育1小时后，使用酶标仪读取信号（激发波长320/340 nm，检测发射波长620 nm和665 nm）。

图4. HTRF Kinase Binding检测步骤

验证数据

d2荧光受体标记的红色示踪剂示踪剂滴定曲线

几种激酶结合剂的剂量依赖性抑制曲线

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