实时荧光定量PCR(qPCR)技术基本原理介绍

实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光标记物，通过实时监测每个PCR循环中的荧光信号变化，实现对起始模板量的定量分析的技术。这项技术由美国Applied Biosystems公司在1995年推出，标志着PCR技术从定性分析到定量分析的飞跃。

实时荧光定量PCR（qPCR）的基本原理包括三个主要阶段，这些阶段反映了PCR扩增过程中的荧光信号变化：

1、基线期：在PCR反应开始时，荧光信号几乎不变，主要是因为背景荧光的存在掩盖了PCR产物的荧光信号。这一阶段的荧光信号变化不大，接近一条直线，用于设置基线。

2、指数期：随着PCR循环的进行，目标DNA序列被指数级扩增，荧光信号随之增加。这一阶段荧光信号呈指数增长，PCR产物量与起始模板量呈线性关系，是进行定量分析的理想阶段。

3、平台期：当PCR反应接近完成时，由于DNA聚合酶活性下降、底物耗尽或抑制物积累，扩增效率降低，荧光信号的增加趋于平缓，最终停止。这一阶段荧光信号不再显著增加，PCR产物达到饱和状态。

在指数期，通过设定荧光阈值（阈值循环数，Ct值），可以准确地对样品中的初始模板量进行定量分析。Ct值越小，说明初始模板量越大。利用标准曲线，可以将Ct值转换为模板的起始拷贝数，实现对目标序列的定量检测。

实时荧光定量PCR技术中有几个重要的概念，包括扩增曲线、基线、荧光阈值和域值循环数。
1、扩增曲线（amplification curve）: 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
2、基线（baseline）：是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。
3、荧光阈值（threshold）:是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。
4、阈值循环数:表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。