冻干人外周血细胞的方法、意义及应用

 人外周血细胞常温或者通常情况下保存周期短，需要超低温设备，使用时不方便，为了提高其应用价值开发了冻干型人外周血细胞冻干法。冻干型外周血细胞具有以下优点：

长期保存细胞：冻干技术可使外周血细胞处于休眠状态，长期保存细胞活性和功能，在需要时快速复苏用于研究或治疗，如保存免疫细胞用于后续免疫疗法研究。

• 方便运输与共享：冻干后细胞便于运输，减少特殊设备需求和运输成本，利于不同实验室和医疗机构间共享细胞资源，促进科研合作和临床应用。

• 稳定细胞特性：能有效保持细胞的生物学特性，包括细胞表面标志物、细胞活性、细胞功能等，确保后续研究和应用的准确性。

• 应急储备：在自然灾害、战争等紧急情况下，作为细胞储备，及时用于输血、细胞治疗等，保障医疗需求。

冻干型外周血细胞是采用真空冷冻干燥的方法进行除水干燥的，干燥后的样品外冻干粉饼，保存在棕色避光型西林瓶中，使用时可以加水或者复溶剂快速复溶。

冻干外周血细胞的流程：

  1. 细胞准备：收集外周血细胞，通过离心等方法去除杂质和血浆成分，得到纯度较高的细胞悬液，调整细胞浓度至适宜范围，如 1×10⁶-1×10⁷ cells/mL。

  2. 添加保护剂：将冻干保护剂按一定比例加入细胞悬液中，轻轻混匀，使细胞充分与保护剂混合均匀。

  3. 预冻：将含有保护剂的细胞悬液放入低温环境中预冻，如放入-80℃冰箱冷冻 2-4 小时或在液氮中快速冷冻，使细胞内的水分冻结，形成细小的冰晶，减少冰晶对细胞的损伤。

  4. 升华干燥：将预冻后的细胞放入冻干设备中，开启真空泵，降低压力，使冰晶在低温低压下直接升华为水蒸气并被移除，此过程需要严格控制温度和压力，防止细胞过热或过度干燥。

  5. 后处理：升华干燥完成后，继续在真空或充入惰性气体的环境下进行后处理，如进一步降低温度，使残余的水分冻结并升华，确保细胞充分干燥，最后密封保存。

冻干后评价方法

• 细胞存活率测定：通过台盼蓝拒染法、CCK-8 法等检测冻干复苏后细胞的存活率，评估细胞的活性。

• 细胞活性检测：采用流式细胞术检测细胞的增殖能力、细胞周期分布等指标，了解细胞的功能状态；还可通过检测细胞内酶的活性等指标，评估细胞的代谢功能。

• 细胞功能评估：对于特定类型的免疫细胞，如 T 细胞、NK 细胞等，可检测其分泌细胞因子的能力、杀伤活性等，以评估细胞的功能完整性。

• 细胞表面标志物检测：利用流式细胞术检测细胞表面特定标志物的表达情况，判断细胞的类型和状态是否发生改变。

未来应用

• 个性化医疗：根据患者的个体差异，冻干保存患者自身的外周血细胞，用于未来的个性化治疗，如 CAR-T 细胞疗法等，提高治疗效果和安全性。

• 细胞治疗：为细胞治疗提供更稳定、可靠的细胞来源，如冻干的造血干细胞可用于治疗血液系统疾病，冻干的免疫细胞可用于肿瘤的免疫治疗等。

• 生物制药：在生物制药领域，冻干人外周血细胞可用于生产细胞来源的生物制品，如细胞因子、抗体等，提高生物制品的质量和稳定性。

• 基础研究：为研究人体免疫系统、血液系统等提供便利，科研人员可随时获取冻干的外周血细胞进行实验，深入研究细胞的生理功能、病理机制等。