高比例辅助脂质mRNA-LNP递送系统的肝外组织递送研究

材料

方法

1. LNP制备：通过微流控混合法，将脂质（ESM、胆固醇、可电离脂质、PEG-DMG）与mRNA在乙醇和缓冲液中混合，形成LNP。调控ESM/胆固醇与可电离脂质的摩尔比（RB/I）从9至0.43。

2. 表征：使用冷冻电镜（cryo-TEM）解析LNP的纳米结构，动态光散射（DLS）测定粒径，BCA法测定蛋白吸附量，质谱分析蛋白冠组成。

3. 体外转染实验：在Huh7细胞中评估不同RB/I的LNP转染效率。

4. 体内实验：通过尾静脉注射LNP至CD-1小鼠，使用SPECT/CT成像追踪体内分布，评估脾脏、淋巴结等组织的转染效率。

实验结果

3.1 LNP的形态与结构：

通过冷冻电镜（cryo-TEM）对不同RB/I（双层脂质ESM/胆固醇与可电离脂质的摩尔比）的LNP进行观察，结果发现：

RB/I=4：在此比例下，约84%的LNP呈现出典型的脂质体结构，其核心为电子致密的固态结构，悬浮于水性腔室中，并被完整的脂质双层包裹。固态核心占据LNP内部空间的约30%，这一结构特征与预期相符，表明高比例的双层脂质有助于形成稳定的脂质体形态。

RB/I降低：随着RB/I值的降低，LNP的形态逐渐发生变化。当RB/I降至2.3及以下时，LNP开始呈现出部分脂质双层包裹固态核心的结构，固态核心与脂质双层之间的界面变得模糊，部分区域可见固态核心直接暴露于水性环境中。这一现象表明，双层脂质的比例对LNP的形态具有决定性影响。

Fig. 1 | Morphological and in vitro transfection properties of LNP mRNA systems formulated using various bilayer lipid to ionizable lipid molar ratios (RB/I).

3.2 体外转染效率：

在Huh7细胞中评估不同RB/I的LNP转染效率，结果显示：

高效转染：RB/I=4-0.67的LNP在Huh7细胞中表现出高效的转染能力，其转染效率显著高于Onpattro样配方（RB/I≈1）。特别是在RB/I=4时，转染效率达到最高，这一结果验证了脂质体结构对提升转染效率的积极作用。

转染效率与形态的关系：转染效率与LNP的形态密切相关。具有完整脂质双层结构的LNP（RB/I=4）展现出最高的转染效率，而随着脂质双层结构的破坏（RB/I降低），转染效率也随之下降。这一发现进一步强调了脂质体结构在mRNA递送中的重要性。

3.3 体内分布与转染效率：

通过尾静脉注射LNP至CD-1小鼠，并使用SPECT/CT成像追踪体内分布，结果显示：

长循环特性：与Onpattro样配方相比，RB/I=4的脂质体LNP在血液循环中的半衰期显著延长（约15倍）。这一长循环特性归因于脂质体结构降低了血浆蛋白的吸附，从而减少了单核-巨噬细胞系统（MPS）的清除。

肝外组织转染：脂质体LNP在脾脏和腹股沟淋巴结的转染效率分别提高了50倍和150倍。此外，在心脏、乳腺、胰腺等组织中也观察到了显著的mRNA表达。这一结果表明，脂质体LNP具有广泛的组织分布能力，为实现肝外组织的mRNA递送提供了可能。

3.4 蛋白冠分析：

通过质谱分析比较脂质体LNP与Onpattro样LNP的蛋白冠组成，结果显示：

蛋白总量减少：脂质体LNP的蛋白冠总量比Onpattro样LNP减少了约2倍。这一减少主要归因于脂质体结构降低了血浆蛋白的吸附。

特定蛋白吸附降低：在脂质体LNP的蛋白冠中，免疫球蛋白Ighv10-1和纤维蛋白原Fgb的吸附显著降低。这些蛋白的减少有助于降低MPS的识别和清除，从而延长LNP在血液循环中的时间。

蛋白组成变化：脂质体LNP的蛋白冠中，免疫蛋白比例减少了4.4%，而载脂蛋白比例增加了3.6%。这种组成变化可能有助于LNP在血液循环中的稳定性和靶向性。

3.5 包封和转染过程及相关机制：

讨论

本研究通过调控双层脂质与可电离脂质的摩尔比，成功开发了一种具有脂质体形态的长循环LNP-mRNA递送系统。该系统不仅显著降低了血浆蛋白吸附，延长了血液循环半衰期，还在脾脏和淋巴结等肝外组织中实现了高效的转染。这一突破为mRNA疗法在肝外疾病治疗中的应用提供了新的可能性。

未来的研究将进一步探索该系统在其他肝外组织中的转染效率，并优化LNP的配方和制备工艺，以提高其稳定性和安全性。

参考文献：Cheng, Miffy Hok Yan, et al. "Liposomal lipid nanoparticles for extrahepatic delivery of mRNA." Nature Communications 16.1 (2025): 4135.