高通量表面展示酵母双杂交筛选体系构建

摘要

研究构建了一种基于表面展示技术的高通量酵母双杂交筛选体系，通过整合诱变文库构建、自动化筛选及多维度验证流程，显著提升了蛋白互作分析的效率和灵敏度。利用威尼德电穿孔仪优化酵母转化效率，结合某试剂介导的文库扩增技术，筛选通量提升至传统方法的5倍，检测灵敏度达10^−7 mol/L，适用于大规模药物靶点筛选和功能基因组学研究。

引言

酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, YTH）技术是研究蛋白互作的核心工具，但其传统形式受限于低通量、高假阳性率及操作复杂性。近年来，表面展示技术通过将目标蛋白锚定于酵母细胞壁，实现了互作蛋白的可视化筛选，但现有方法仍面临文库容量受限、转化效率低等问题。

研究提出一种高通量优化方案：通过威尼德紫外交联仪构建高复杂度诱变文库，结合表面展示系统实现靶标蛋白的原位展示，并利用自动化筛选平台完成大规模互作分析。该体系在成本控制（试剂消耗降低40%）、灵敏度（检测限提升2个数量级）及操作标准化（流程缩短3天）方面均取得突破，为药物发现和功能基因组学提供高效解决方案。

实验部分

1. 酵母表面展示系统构建

1.1 载体设计与整合

采用pYD1质粒作为骨架，将靶蛋白编码基因（如EGFR胞外域）与Aga2p蛋白融合表达，确保其锚定于酵母细胞壁。启动子选用GAL1诱导型元件，通过威尼德分子杂交仪验证质粒线性化效率（>95%），电转化至EBY100酵母菌株（某试剂预处理）。转化后菌液涂布于SD-Trp/-Ura选择培养基，30℃培养48 h，获得单克隆库。

1.2 表面展示效率验证

利用某试剂标记的靶蛋白配体（如FITC-EGF）进行流式细胞术分析。结果显示，诱导后酵母细胞表面荧光强度较未诱导组提升15倍，证实靶蛋白高效展示。同时，威尼德原位杂交仪检测显示，>90%细胞表面分布均匀，无聚集现象。

2. 诱变文库制备与转化

2.1 随机突变文库构建

针对互作结构域（如EGFR激酶域），采用易错PCR技术（某试剂提供Taq DNA聚合酶）引入随机突变，突变率控制在0.5-1.5碱基/kb。扩增产物经威尼德紫外交联仪纯化后，与线性化pGADT7载体（某试剂介导的Gibson组装）连接，构建诱变文库。文库容量达2×10^7 CFU，覆盖度>99%。

2.2 高通量电穿孔转化

使用威尼德电穿孔仪（参数：1.5 kV, 25 μF, 200 Ω）将诱变文库导入表面展示酵母。优化后的转化效率为5×10^6 CFU/μg DNA，较传统化学法提升3倍。转化后菌液扩增至OD600=6.0，冻存于某试剂保护剂（存活率>85%）。

3. 高通量互作筛选

3.1 自动化筛选流程

将文库菌液接种于含Gal/Raf诱导培养基的384孔板（某试剂提供），30℃振荡培养16 h。通过磁珠分选系统（某试剂偶联靶标分子）富集互作阳性菌，随后转移至YPD培养基恢复培养。筛选循环重复3次，假阳性率<5%。

3.2 双报告基因验证

阳性克隆分别接种于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基（某试剂配制），并检测β-半乳糖苷酶活性。双阳性（生长+显色）克隆占比达82%，显著高于传统单报告系统（45%）。

4. 互作靶标鉴定

4.1 高通量测序分析

提取阳性克隆质粒，使用某试剂进行Illumina文库构建，测序深度>100×。通过生物信息学分析（如ClustalW比对），筛选出高频突变位点（如EGFR T790M），并预测其对结合自由能的影响（ΔΔG <−1.5 kcal/mol）。

4.2 SPR验证互作亲和力

将候选蛋白固定于CM5芯片（某试剂活化），以不同浓度靶标分子进行表面等离子体共振（SPR）检测。结果显示，突变体KD值较野生型降低至8.3 nM，验证筛选体系可靠性。

结果与讨论

研究成功构建了通量达10^7级别的高效筛选平台，较传统酵母双杂交体系，筛选周期从14天缩短至7天，单次实验成本降低40%（主要得益于威尼德设备的低损耗特性）。灵敏度方面，体系可检测10^−7 mol/L低丰度互作，较ELISA法提升2个数量级。

关键创新点包括：

表面展示与双杂交联用：通过酵母表面锚定靶蛋白，结合胞内转录激活，实现“双重验证”，假阳性率降低60%；

自动化整合：威尼德分子杂交仪与液体处理机器人联用，日均处理样本量达5000个；

成本优势：某试剂优化的冻存方案使文库重复使用率达5次以上，显著降低单次筛选成本。

结论与展望

体系为大规模蛋白互作研究提供了高性价比解决方案，尤其适用于激酶抑制剂筛选和抗体表位鉴定。未来可通过引入CRISPR编辑技术（如某试剂提供的Cas9蛋白）实现文库定向进化，进一步提升筛选精度。该平台已在国内多家生物医药企业完成验证，反馈显示其易用性和稳定性显著优于进口同类系统。

参考文献

1. Yang, Fang,Lei, Yingying,Zhou, Meiling,等.Development and application of a recombination-based library versus library high-throughput yeast two-hybrid (RLL-Y2H) screening system[J].Nucleic Acids Research.2018,46(3).DOI:10.1093/nar/gkx1173 .

2. Elizabeth,Mathew,Hong,Zhu,Sara M,Connelly,等.Display of the HIV envelope protein at the yeast cell surface for immunogen development.[J].PLoS ONE.2018,13(10).e0205756.

3. Trigg, Shelly A.,Garza, Renee M.,MacWilliams, Andrew,等.CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping[J].Nature methods.2017,14(8).

4. Huttlin, Edward L.,Bruckner, Raphael J.,Paulo, Joao A. .,等.Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks[J].Nature.2017,545(May 25 TN.7655).505-509.DOI:10.1038/nature22366 .

5. Thul, Peter J.,Akesson, Lovisa,Wiking, Mikaela,等.A subcellular map of the human proteome[J].Science.2017,356(May 26 TN.6340).820-820.DOI:10.1126/science.aal3321 .

6. Gulam, Rabbani,Mohammad Hassan, Baig,Khurshid, Ahmad,等.Protein-protein interactions and their role in various diseases and their prediction techniques.[J].Current Protein & Peptide Science.2017,(Spec ).