Tiangen DP117无内毒素质粒大提试剂盒用户指南：高纯度质粒制备技术方案

Tiangen DP117无内毒素质粒大提试剂盒用户指南：高纯度质粒制备技术方案

一、产品核心特性与工作原理

1. 技术优势与试剂盒组成

• 核心特性：

• 高效去内毒素：采用硅胶膜吸附技术结合去内毒素系统，内毒素去除率＞99%，残留量＜0.1 EU/μg DNA，符合细胞转染及动物实验标准；

• 超螺旋结构保留：通过温和裂解体系（P2缓冲液）与多步离心过滤（CS1过滤器），超螺旋质粒占比＞85%，显著提升转染效率；

• 高通量处理：单次可处理100-200 mL菌液，高拷贝质粒得率达500-1500 μg，低拷贝质粒得率200-600 μg，满足大规模实验需求。

• 试剂盒组成：

• 裂解系统：溶液P1（含RNase A）、溶液P2（裂解液）、溶液P4（中和液）；

• 纯化系统：平衡液BL、漂洗液PW（含无水乙醇）、无水乙醇、洗脱液TB；

• 耗材：吸附柱CP6（50 mL离心管适配）、收集管、过滤器CS1。

2. 适用范围与兼容性

• 下游应用：

• 常规实验：酶切、PCR、测序、连接、转化；

• 实验：基因治疗载体构建、显微注射、RNA干扰、CRISPR-Cas9基因编辑；

• 细胞实验：适用于内毒素敏感型细胞（如Huh7、HEK293T）的转染，转染效率较普通质粒提升30%-50%。

• 质粒兼容性：

• 拷贝数：高拷贝质粒（如pUC19）推荐菌液量100 mL，低拷贝质粒（如pBR322）推荐菌液量200 mL；

• 大小范围：支持1-20 kb质粒提取，对于＞10 kb大质粒，需增加菌液量及裂解液体积。

二、典型应用场景与实验方案

1. 基因治疗载体构建

• 实验设计：

1. 使用DP117提取慢病毒载体骨架质粒（如pLVX-IRES-ZsGreen1），菌液量200 mL；

2. 定量检测浓度（OD260）及纯度（OD260/OD280=1.8-2.0），琼脂糖凝胶电泳验证超螺旋结构；

3. 结合Lipofectamine 3000转染293T细胞，48小时后荧光显微镜观察转染效率＞80%。

• 结果示例：

• 提取的质粒浓度达1.2 μg/μL，内毒素含量0.05 EU/μg，显著低于普通试剂盒（＞1 EU/μg）；

• 慢病毒滴度达1×10⁸ TU/mL，较含内毒素质粒提升40%。

2. CRISPR-Cas9基因编辑

• 实验设计：

1. 提取sgRNA表达质粒（如pX458），菌液量100 mL；

2. 通过DP117去除内毒素，避免非特异性免疫激活；

3. 核转染HeLa细胞，72小时后T7E1酶切验证编辑效率＞35%。

• 结果示例：

• 提取的质粒OD260/OD280=1.85，内毒素未检出；

• 基因编辑效率较含内毒素质粒提升25%，脱靶率降低15%。

3. 动物体内实验

• 实验设计：

1. 提取治疗性基因表达质粒（如pAAV-CMV-GFP），菌液量200 mL；

2. 通过DP117确保内毒素＜0.1 EU/μg，避免小鼠注射后发热反应；

3. 尾静脉注射C57BL/6小鼠（50 μg/只），7天后肝脏组织GFP荧光强度较含内毒素质粒组提升60%。

• 结果示例：

• 质粒纯度（OD260/OD280=1.92）及内毒素水平符合FDA要求；

• 动物存活率100%，无炎症反应。

三、操作规范与注意事项

1. 实验前准备

• 试剂配制：

1. 溶液P1：加入RNase A后混匀，4℃保存；

2. 漂洗液PW：按标签要求加入无水乙醇；

3. 洗脱液TB：65-70℃预热以提高洗脱效率。

• 仪器校准：

• 离心机：确保转速误差＜2%（8000 rpm对应8228×g）；

• 移液器：定期校准，避免体积误差。

2. 操作流程

• 菌体收集：

1. 100-200 mL菌液8000 rpm离心3分钟，弃上清；

2. 菌体沉淀用吸水纸吸干残留培养基。

• 裂解与中和：

1. 加入8 mL溶液P1，涡旋振荡至菌体悬浮；

2. 加入8 mL溶液P2，温和翻转6-8次，室温放置5分钟；

3. 加入8 mL溶液P4，立即翻转6-8次，室温放置10分钟。

• 过滤与纯化：

1. 裂解液8000 rpm离心5分钟，上清倒入过滤器CS1，缓慢推动推柄过滤；

2. 滤液加入0.3倍体积异丙醇，分两次过吸附柱CP6；

3. 依次加入10 mL漂洗液PW、3 mL无水乙醇洗涤，8000 rpm离心2分钟弃废液；

4. 空柱8000 rpm离心5分钟，去除乙醇残留。

• 洗脱与保存：

1. 吸附柱置于新收集管，加入1-2 mL预热洗脱液TB，室温放置5分钟；

2. 8000 rpm离心2分钟，收集质粒溶液，-20℃保存。

3. 实验后处理

• 废弃物处理：

• 含内毒素的菌体沉淀及滤液按生物危害品处理；

• 染菌的耗材121℃高压灭菌30分钟。

• 仪器维护：

• 吸附柱CP6为一次性耗材，禁止重复使用；

• 离心机转子用70%乙醇擦拭，避免腐蚀。

四、常见问题解答

Q1：提取的质粒浓度低如何解决？
A：

1. 检查菌液OD600值，推荐高拷贝质粒1.8-2.0，低拷贝质粒2.0-2.5；

2. 确保菌体悬浮，避免裂解不充分；

3. 延长洗脱时间至10分钟，或重复洗脱一次。

Q2：内毒素残留超标怎么办？
A：

1. 确认溶液P4与CS1过滤器未过期；

2. 裂解液离心时间延长至15分钟，确保内毒素充分沉淀；

3. 使用LAL法验证内毒素水平，必要时增加乙醇洗涤次数。

Q3：如何提高大质粒（＞10 kb）的得率？
A：

1. 菌液量增加至300 mL，裂解液P1/P2/P4按比例增加至12 mL；

2. 洗脱液TB预热至70℃，洗脱体积增加至3 mL；

3. 吸附后静置10分钟再离心，增强结合效率。